一種β-環(huán)糊精/聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒復合物及其制備和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于納米復合物及其制備和應用領域，特別涉及一種β-環(huán)糊精/聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒復合物及其制備和應用。
【背景技術】
[0002]RNA干擾(RNAi)是指由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(dsRNA)弓丨發(fā)而導致特異性基因轉錄后出現(xiàn)基因沉默的現(xiàn)象。在細胞內，dsRNA特異性的核酸酶將其裂解成不超過21-25個核苷酸的小干擾RNA(s iRNA)，隨后介導特異性的mRNA發(fā)生降解，導致相應基因表達被阻斷而引起基因沉默。該技術已被廣泛應用于基因治療的研究中。
[0003]基因治療作為一種現(xiàn)代醫(yī)學和分子生物學相結合而誕生的新技術，是通過將外源正?；驅氚屑毎麅?，用以糾正或補償基因缺失或異常引起的疾病，從而進行疾病治療。然而，目前基因治療最主要的障礙就是缺乏一種安全有效的載體。在基因載體系統(tǒng)中，主要借助病毒和非病毒載體將外源基因導入靶細胞。病毒載體轉染效率高，但臨床應用的安全隱患制約了其進一步的應用。而非病毒載體，由于其低細胞毒性、無免疫原性、易操作和高基因裝載量等特點，越來越受到研究者們的關注。
[0004]非病毒載體中，聚酰胺胺樹狀大分子(PAMAM)是目前研究最深入的樹狀大分子之一，它獨特的高度支化三維立體結構令其成為一種新型的高分子載體被廣泛應用于基因傳遞中。研究表明，PAMAM的基因轉染效率和細胞毒性會隨著其代數(shù)的增加而增加。而第五代(G5)PAMAM雖然有一定的毒性，但可以通過內部包裹納米金顆粒[Shan,Y.，Luo，T.，et al.，Gene delivery using dendrimer-entrapped gold nanoparticles as nonviralvectors[J].B1materials,2012,33(10):p.3025-3035]或進行表面修飾[史向陽，侯文秀，郭睿，孔令丹.包裹納米金顆粒的PEG功能化的PAMAM樹狀大分子載體的基因轉染方法[P].中國專利:201310728846.2，2014-04-09]等手段降低其細胞毒性并增強轉染能力。
[0005]Wang等[Wang，H.，N.Shao，et al.,Host-guest chemistry of dendrimer-cyclodextrin conjugates: Selective encapsulat1ns of guests within dendrimeror cyclodextrin cavities revealed by NOE NMR techniques[J].J Phys Chem B,2012，116 (36): p.11217-11224.]證明，將環(huán)糊精分子共價連接到G5PAMAM表面，可以增強G5PAMAM的水溶性及細胞攝入率。檢索國內外相關文獻和專利結果表明:以β-CD修飾的樹狀大分子及其納米金顆粒為載體，負載siRNA用于惡性膠質瘤細胞(U87MG)基因轉染的方法，尚未見報道。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種β_環(huán)糊精/聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒復合物及其制備和應用，本發(fā)明制備過程簡單，實驗條件溫和，易操作;本發(fā)明所得復合物具有較好的生物相容性及基因轉染效率。
[0007]本發(fā)明的一種β-環(huán)糊精/聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒復合物，所述復合物為β-環(huán)糊精β-CD與第五代聚酰胺-胺樹狀大分子表面氨基基團共價結合并負載金納米顆粒。
[0008]本發(fā)明的一種β-環(huán)糊精/聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒復合物的制備方法，包括:
[0009](I)分別將Ν，Ν’ -羰基二咪唑⑶I和β-環(huán)糊精β-⑶溶解于溶劑中，混勻4_6h，得到混合液，然后向混合液中逐滴加入第五代聚酰胺-胺樹狀大分子G5.NH2溶液，繼續(xù)室溫攪拌1-3天，經(jīng)透析，冷凍干燥，得到白色粉末G5.NH2KD;其中⑶I與β-⑶的摩爾比為5:1?10:1，β-CD與G5.NH2的摩爾比為25: I ；
[0010](2)在劇烈攪拌條件下，將G5.ΝΗ2-β_⑶的水溶液中逐滴加入氯金酸水溶液，反應20-30min，然后迅速加入硼氫化鈉NaBH4的冰水溶液，繼續(xù)反應2_4h，透析，冷凍干燥，得到
環(huán)糊精/聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒復合物Au DENPs-P-CD;其中G5.NH2與HAuCl4.4H20的摩爾比為 1:25，HAuC14.4H20與NaBH4的摩爾比為1:5?1:10。
[0011 ] 步驟(I)中溶液的溶劑均為二甲基亞砜DMS0。
[0012]步驟(I)中N，N’ -羰基二咪唑⑶I溶解于溶劑中的濃度為111.36ymol/mL，β-環(huán)糊精β-⑶溶解于溶劑中的濃度為11.14ymol/mL；(不是在混合液中的濃度，是溶解于DMSO溶劑中的濃度)
[0013]第五代聚酰胺-胺樹狀大分子G5.NH2溶液的濃度為0.44ym0l/mL;第五代聚酰胺-胺樹狀大分子G5.NH2溶液的溶劑為二甲基亞砜DMSO。
[O 014 ] 步驟(2)中氯金酸水溶液的濃度為3 O m g / m L;硼氫化鈉N a B H 4的冰水溶液濃度為lOmg/mL。
[OO15 ]步驟(2)中溶液的溶劑均為超純水。
[0016]步驟(I)、(2)中透析均為:使用的透析袋截留分子量為8000-14000 ；用I3BS緩沖溶液透析I天后更換超純水透析2天，每天3次，每次2L。
[0017]本發(fā)明的一種β-環(huán)糊精/聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒復合物的應用，β-環(huán)糊精/聚酰胺-胺樹狀大分子/金納米顆粒復合物Au DENPS-β-CD作為非病毒載體負載SiRNA進行基因轉染的應用。
[0018]Au DENPs-β-⑶作為載體應用于惡性膠質瘤細胞U87MG基因轉染，具體為:按照不同Ν/Ρ比，取無菌水分別稀釋Au DENPs-f3-CD及siRNA，而后均勻混合，于37°C條件孵育15-30min，得到不同N/P比的Au DENPs-0-CD/siRNA復合物；將U87MG細胞于37 °C、5 %⑶2培養(yǎng)24h，更換無血清的DMEM培養(yǎng)基，加入不同N/P比的Au DENPs-f3_CD/siRNA復合物溶液，37°C培養(yǎng)4h進行基因轉染;其中N/P比為第五代聚酰胺-胺樹狀大分子的表面氨基基團與siRNA骨架上磷酸基團摩爾比。
[0019]所述siRNA為B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)siRNA或血管內皮生長因子VEGF siRNA。
[0020]不同N/P比分別為2.5:1、5:1和10:1。
[0021]本發(fā)明將β-CD與G5PAMAM表面氨基基團共價結合，可以通過中和其部分表面氨基以降低材料的細胞毒性，并提高材料的生物相容性。
[0022]本發(fā)明將HAuCU.4H20加入到含G5PAMAM的溶液中，快速攪拌使HAuCU.4H20與G5PAMAM充分混合，后快速加入NaBH4還原得到納米金顆粒，避免了納米金顆粒的聚集。
[0023]本發(fā)明以β-CD修飾聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米金顆粒復合物為載體，分別負載B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)siRNA及血管內皮生長因子(VEGF)siRNA并轉染U87MG細胞。本發(fā)明通過凝膠阻滯實驗對載體與siRNA形成復合物的能力進行表征;通過水動力學粒徑與表面電勢對載體/siRNA復合物的粒徑和電勢進行了分析;通過MTT法測試載體/siRNA復合物對細胞的毒性;通過流式細胞儀測定載體/siRNA復合物的細胞攝入率;通過激光共聚焦顯微鏡檢測載體/s iRNA復合物在細胞內的運輸途徑;通過蛋白質印跡法研究載體對siRNA的基因傳遞能力。
[0024]有益效果
[0025](I)本發(fā)明制備過程簡單，實驗條件溫和，易操作；
[0026](2)本發(fā)明制備的β-CD修飾的聚酰胺-胺樹狀大分子及其納米金顆粒復合物具有良好的基因轉染效果；
[0027](3)本發(fā)明的材料轉染過程易于操作，生物相容性好，在基因治療等生物醫(yī)學方面具有良好的應用潛力。
【附圖說明】
[0028]圖1為實施例2中的載體/Bel_2s iRNA復合物的凝膠阻滯實驗