電泳圖譜；
[0029]圖2為實(shí)施例2中的載體/VEGFsiRNA復(fù)合物的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)電泳圖譜；
[0030]圖3為實(shí)施例3中的載體/Bcl-2siRNA復(fù)合物(a)和載體/VEGFsiRNA復(fù)合物(b)的水動(dòng)力學(xué)粒徑圖；
[0031]圖4為實(shí)施例3中的載體/Bcl-2siRNA復(fù)合物(a)和載體/VEGFsiRNA復(fù)合物(b)的表面電勢圖；
[0032]圖5為實(shí)施例4中的載體/Bcl-2siRNA復(fù)合物(a)和載體/VEGF siRNA復(fù)合物(b)對U87MG的細(xì)胞毒性結(jié)果圖；
[0033]圖6為實(shí)施例5中的載體/Cy3-Bcl-2siRNA復(fù)合物(a)和載體/Cy3-VEGF siRNA復(fù)合物(b)的U87MG細(xì)胞內(nèi)吞結(jié)果圖；
[0034]圖7為實(shí)施例6中的載體/Cy3-Bcl-2siRNA復(fù)合物對U87MG的細(xì)胞胞內(nèi)定位結(jié)果圖；
[0035]圖8為實(shí)施例6中的載體/Cy3-VEGFsiRNA復(fù)合物對U87MG的細(xì)胞胞內(nèi)定位結(jié)果圖；
[0036]圖9為實(shí)施例7中的載體/Bcl-2siRNA復(fù)合物對U87MG的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；其中(a)為Western blot的蛋白條帶圖，b為蛋白條帶的灰度定量圖；
[0037]圖10為實(shí)施例7中的載體/VEGF siRNA復(fù)合物對U87MG的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；其中(a)為Western blot的蛋白條帶圖，b為蛋白條帶的灰度定量圖；
[0038]圖11為本發(fā)明中β-環(huán)糊精修飾聚酰胺-樹狀大分子及其納米金顆粒復(fù)合物的制備示意圖。
[0039]注:附圖中的QO、Q1和Q2均分別為:G5PAMAM、對比例I制備得到的Au DENPs和實(shí)施例I的方法制備得到的Au DENPs-β-Ο);
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0041 ] 實(shí)施例1
[0042]稱取90.3mg CDI和63.2mg0_CD分別溶解于5mL的DMSO中，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)6h。而后向溶液中逐滴加入5mL溶有57.9mg第五代聚酰胺胺樹狀大分子(G5PAMAM)的DMSO溶液，室溫?cái)嚢?天。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至截留分子量為8000-14000Da的透析袋中，于磷酸鹽(PBS)緩沖液中透析I天后，更換為超純水中透析2天，最后經(jīng)冷凍干燥得到白色粉末狀產(chǎn)物G5.NH2KD。而后稱取39.5mg的G5.NH2KD溶解于5mL超純水中，在劇烈攪拌下逐滴加入322.7yL 30mg/mL氯金酸水溶液(HAuCl4.4H20)，持續(xù)攪拌30min后，快速加入445yL 1mg/mL的硼氫化鈉(NaBH4)冰水溶液繼續(xù)反應(yīng)4h。最后將反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為8000-HOOODa的透析袋中在超純水中透析3天以去除多余的反應(yīng)物，冷凍干燥得到最終產(chǎn)物AuDENPs-P-CD0
[0043]實(shí)施例2
[0044]將G5PAMAM、對比例I制備得到的Au DENPs和實(shí)施例1的方法制備得到的Au DENPs-β-CD (分別標(biāo)記為QO、Ql和Q2)按照N/P比分別為0.25、0.5、1、2、3、4和5，siRNA為Iyg/孔配制復(fù)合物進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)。配制含有溴化乙錠(EB)的1%八孔瓊脂糖凝膠，向瓊脂糖凝膠第一孔內(nèi)加入5yL Marker對照組，其余第2_8孔內(nèi)依次加入上述復(fù)合物溶液。于80V電壓電泳451^11，然后通過紫外凝膠分析系統(tǒng)于31211111處拍照分析。結(jié)果表明，所有載體都在~?比2:1以上時(shí)顯示出了完全阻滯siRNA的能力，各載體對Bcl-2siRNA(附圖1)的壓縮能力略弱于對VEGF siRNA(附圖2)的壓縮能力，且在相同N/P比條件下Q2比QO和Ql對siRNA的壓縮包裹能力更強(qiáng)，這意味著G5PAMAM樹狀大分子表面修飾上β-⑶能增強(qiáng)載體對siRNA的包裹能力。
[0045]實(shí)施例3
[0046]將G5PAMAM、對比例I制備得到的Au DENPs和實(shí)施例1的方法制備得到的Au DENPs-β-CD(分別標(biāo)記為Q0、Q1和Q2)在不同的Ν/Ρ比條件下(2.5:1、5:1和10:1)分別與5口8 siRNA通過靜電作用形成載體/siRNA復(fù)合物，于室溫下孵育15-30min后加入ImL PBS緩沖液。通過馬爾文激光粒度儀(Maivern，MK，633nm激光)對其水動(dòng)力學(xué)粒徑及表面電勢進(jìn)行了表征。結(jié)果顯示，在三個(gè)實(shí)驗(yàn)N/P比條件下，載體對Bcl-2siRNA(附圖3a)以及VEGF siRNA(附圖3b)復(fù)合物的水動(dòng)力學(xué)粒徑大小均隨著N/P比增大而減小。而載體對Be 1-2s iRNA (附圖4a)以及VEGF siRNA(附圖4b)復(fù)合物的表面電勢的整體變化趨勢大致相似，Q0、Q1、Q2與siRNA復(fù)合物的表面電勢依次減小。但各載體/siRNA復(fù)合物的水動(dòng)力學(xué)粒徑與表面電勢都處于合適的基因傳遞范圍內(nèi)，這說明各載體都具有良好的壓縮siRNA的能力，適合被細(xì)胞吸附和內(nèi)吞，有利于細(xì)胞內(nèi)基因的傳遞和轉(zhuǎn)移。
[0047]實(shí)施例4
[0048]以惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U87MG)為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)G5PAMAM、對比例I制備得到的AuDENPs和實(shí)施例1的方法制備得到的Au DENPs-P-CD(分別標(biāo)記為QO、Ql和Q2)的細(xì)胞毒性。以8 X 13/孔的密度將U87MG種于96孔板中，培養(yǎng)于添加100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素和10%FBS的200yL DMEM培養(yǎng)液中，于37°C及5%⑶2條件下培養(yǎng)24h。然后將培養(yǎng)基更換為每孔含Iyg siRNA，濃度分別為0nM、100nM、500nM、1000nM、1500n]\^P2000n]\^9Q0/siRNA、Ql/siRNA和Q2/siRNA復(fù)合物的200yL不含血清細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染4h，結(jié)束后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，隨后每孔更換180yL含血清的新鮮培養(yǎng)基并加入20yL 5.0mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。去除孔中的培養(yǎng)液，每孔加入150yL DMSO，搖床振蕩15min，使用多功能酶標(biāo)儀于570nm處測試吸光值。結(jié)果顯示，載體與Be 1-2 s iRNA (附圖5a)以及VEGF s i RNA (附圖5b)復(fù)合物在U87MG細(xì)胞內(nèi)的MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢一致，細(xì)胞活力都隨著載體的濃度升高而降低。在相同的實(shí)驗(yàn)濃度下，毒性大小從小到大依次是Q2/siRNA、Ql/siRNA和QO/siRNA復(fù)合物。這意味著相較于QO和Ql，Q2作為基因載體應(yīng)用于基因治療會(huì)更加安全，證明了無論是表面修飾β-CD亦或是內(nèi)部包裹納米金顆粒都可以降低G5PAMAM的細(xì)胞毒性。
[0049]實(shí)施例5
[0050 ] 以惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U8 7MG)為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)G 5 PAMAM、對比例I制備得到的AuDENPs和實(shí)施例1的方法制備得到的Au DENPs-f3-CD(分別標(biāo)記為QO、Q1和Q2)的細(xì)胞內(nèi)吞效率。以5 X 14/孔的密度將U87MG種于24孔板中，培養(yǎng)于添加100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素和10%FBS的800yL DMEM培養(yǎng)液中，于37°C及5 %CO2條件下培養(yǎng)24h。隨后將培養(yǎng)基換成900yL不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，按照每孔IyL Cy3_siRNA，N/P比2.5:1、5:1和10:1制備10yL載體/Cy3-siRNA復(fù)合物加入細(xì)胞中轉(zhuǎn)染4h。使用PBS緩沖溶液清洗細(xì)胞，按每孔200yL的胰酶消化細(xì)胞Imin，100rpm離心5min，最后用ImL PBS將獲得的細(xì)胞重新分散。制備好細(xì)胞溶液后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞釋放的紅色熒光，設(shè)定FSH-H/SSC-H為細(xì)胞門，設(shè)定FL2-H為Cy3熒光通道，每個(gè)材料的不同N/P比樣品采取I X 104，重復(fù)三次。各材料與Cy3-Bcl-2siRNA復(fù)合物(附圖6a)及Cy3-VEGF siRNA復(fù)合物(附6b)在U87MG細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)吞流式結(jié)果顯示，對兩種不同的siRNA而言，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的N/P比條件下，Cy3-siRNA的紅色熒光信號(hào)強(qiáng)度都隨著N/P比的增加而增加，各載體