一種精子質(zhì)量評估的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)療檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種精子質(zhì)量評估的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會工業(yè)的不斷發(fā)展，不育夫婦的總發(fā)病率明顯升高。2004年歐洲生殖學(xué)會 統(tǒng)計(jì):育齡夫婦許內(nèi)不能懷孕者占25%，其中15%尋求治療，男方因素引起不育占50%。男性 不育的病因有性功能障礙(1.7% )，精索靜脈曲張（12. 3% )，生殖道感染(6.6%)，先天性發(fā) 育異常(2.1%)后天獲得性疾病(2.6% )，內(nèi)分泌素亂(0.6%)，免疫性因素(3.1%)，其他異常 (3%)，但是高達(dá)60%~75%的患者找不到原因，稱為特發(fā)性男性不育，他們只表現(xiàn)為少精、弱精 或崎形精子癥等精子質(zhì)量異常。不明原因的男性不育可能由于多種因素造成，如長期應(yīng)激 環(huán)境因素引起內(nèi)分泌素亂、活性氧和基因缺陷等。
[0003] 多年來，傳統(tǒng)的精液常規(guī)分析一直是用于判斷男性生育力的最基本臨床指標(biāo)。臨 床上對絕大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚。尤其是臨床上大約有Ξ分之 一不育患者，男性的常規(guī)精液分析結(jié)果均正常和接近正常。臨床上把運(yùn)類患者劃為不明原 因不育癥。因此，長期W來，臨床對男性不育的診斷存在很大的困難。最主要的原因是常規(guī) 精液分析只測定精子的數(shù)量，存活力，活動率和形態(tài)。運(yùn)些指標(biāo)只能反映最基本的精液質(zhì) 量，不能反映所有的精子功能，比如，精子核的成熟和DNA損傷，精子與人卵透明帶結(jié)合反應(yīng) 與穿透，頂體狀況和反應(yīng)及與卵黃膜結(jié)合能力等。因此，需要建立特殊的精子功能試驗(yàn)才能 測定W上運(yùn)些功能。精子獲能是精卵結(jié)合形成受精卵的必要條件，雖然精子獲能的相關(guān)研 究已有一些進(jìn)展，但仍然存在很多尚未闡明的問題。
[0004] 臨床工作中，一部分原發(fā)或繼發(fā)的不育男性病人利用現(xiàn)有的常規(guī)精液質(zhì)量檢查項(xiàng) 目提示精子及精液質(zhì)量無異常。目前常用的精子檢測手段為CASA(計(jì)算機(jī)輔助精子分析 Computer aided of semen analysis)，W及抗精子抗體等。當(dāng)今最為廣泛使用的CASA技術(shù) 和一些形態(tài)學(xué)的相關(guān)檢測，主要能評價(jià)精子的活動能力和活精子比率，從而推測其進(jìn)入女 性生殖道的受精能力，而依賴目前的精子功能評價(jià)體系，對精子質(zhì)量及功能的評價(jià)存在一 定的缺陷，W及難于給病人提供相應(yīng)的臨床咨詢。事實(shí)上，運(yùn)僅僅是評價(jià)精子功能的一個(gè)方 面，我們應(yīng)該考慮到可能還有影響精子生殖能力的更多沒有被掲示的因素。
[0005] 在先專利201310431847.0,提出了一種影響精子功能的唾液酸酶檢測方法。第一 步，通過單精子巧光強(qiáng)度分析直觀的量化唾液酸酶在精子中的表達(dá)，或者利用顯微鏡下巧 光成像直觀的觀察唾液酸酶在精子中的表達(dá);若唾液酸酶在精子中高表達(dá)，則進(jìn)行第二步， 利用體外獲能液使精子影響精子功能的唾液酸酶檢測方法獲能，并用巧光法檢測唾液酸酶 活性。該專利雖然公開了唾液酸酶蛋白分子在精子中的表達(dá)和基本活性的檢測。但在檢測 對象上，是對獲能液進(jìn)行的酶活測定，檢測的是對精子進(jìn)行獲能處理后，精子向獲能液中脫 落的唾液酸酶，目的是評估獲能后的精子質(zhì)量。由于精子本身的唾液酸酶活性與獲能液的 酶活不存在必然關(guān)聯(lián)，該方法無法檢測精子本身所含的唾液酸酶，無法對精子本身質(zhì)量進(jìn) 行評估。同時(shí)，在方法上還存在W下缺點(diǎn)：1)技術(shù)流程復(fù)雜;2)對實(shí)驗(yàn)設(shè)備和操作人員技能 和經(jīng)驗(yàn)要求高；3)不適于應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室和常規(guī)技術(shù)人員使用;4)使用abeam公司的試劑 盒，價(jià)格昂貴。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】
： 針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種精子質(zhì)量評估的方法。對精子提取蛋白的精子 功能進(jìn)行測定，采用新鮮及時(shí)的精液測定精子唾液酸酶的總活性，用于評價(jià)男性不育的可 能潛在原因，尤其是針對臨床上不明原因性不育是否與唾液酸酶活性有關(guān)的情況。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案： 一種精子質(zhì)量評估的方法:其特征在于:具體步驟如下： A、精子的洗涂 收集新鮮液化精液標(biāo)本，用憐酸緩沖液或者BWW培養(yǎng)液洗涂精子，充分除去殘留的精漿 成分，再離屯、分離出精子。
[0008] 本發(fā)明先向精液標(biāo)本中加入憐酸緩沖液或者BWW培養(yǎng)液進(jìn)行洗涂，再離屯、分離得 到精子沉淀。運(yùn)是由于精漿本身黏稠，直接對其離屯、不能使精液中所有精子充分沉淀，加入 憐酸緩沖液或者BWW培養(yǎng)液對其進(jìn)行稀釋后，離屯、操作效果更好。
[0009] 優(yōu)選地，對精液進(jìn)行3次離屯、，保證檢測沒有精漿干擾的情況下，盡可能減少離屯、 精子的次數(shù)，保證精子活力。
[0010] B、提取精子蛋白 向A步驟分離出的精子中加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑cocktail,混勻，待無明顯的 細(xì)胞沉淀即充分裂解，在4°C下高速離屯、，上清液即蛋白提取物。
[0011]蛋白酶抑制劑cocktail的加入是用來抑制蛋白酶的作用，蛋白酶的作用是降解蛋 白質(zhì)，而本發(fā)明的待檢物唾液酸酶就是一種蛋白質(zhì)，加入蛋白酶抑制劑可W防止唾液酸酶 被降解。
[0012]優(yōu)選地，所述B步驟的細(xì)胞裂解液不含酶活抑制劑，加入體積為精子體積的2-3倍。 抑制劑會破壞唾液酸酶的活性，會影響后面的酶活測定。2-3倍的加入量可保證檢測的靈敏 度。
[0013]優(yōu)選地，所述的高速離屯、是指W1200化/min的速度離屯、5min，盡可能去掉細(xì)胞(精 子)碎片，否則運(yùn)些碎片會影響檢測的特異性。
[0014] C、測定精子蛋白提取物的蛋白濃度 (1)用細(xì)胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液，再用裂解液按2/1.0/0.5/0.25/ 0.125/0mg/ml的濃度梯度將蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液稀釋為蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，向檢測板內(nèi)依次加入各蛋 白標(biāo)準(zhǔn)溶液;加入待測樣本于檢測板內(nèi)，再加入裂解液稀釋。
[0015] 優(yōu)選地，用細(xì)胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液的濃度為20mg/ml，可 于-20°C長期儲存，便于后面2/1.0/0.5/0.25/0.125/Omg/ml運(yùn)些蛋白濃度梯度的配制。蛋 白標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度根據(jù)精子提取物的蛋白濃度的表達(dá)量和本方法所能檢測到的靈敏度而設(shè) 定的。
[0016] (2)按A:B=50:1的體積比配制試劑A液和B液的混合液，將其加入上述各蛋白標(biāo)準(zhǔn) 溶液和待測樣本的孔內(nèi)，輕輕混勻，將檢測板置于37°C反應(yīng)30min，然后用酶標(biāo)儀讀取各孔 吸光度，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣本的蛋白濃度。
[0017] 優(yōu)選地，所述的檢測板為96孔透明板。
[0018]優(yōu)選地，所述的酶標(biāo)儀在562nm波長下讀取各孔吸光度。
[0019]檢測的孔內(nèi)樣本蛋白濃度應(yīng)在〇.l-2mg/ml范圍內(nèi)，如果超出，則應(yīng)將孔內(nèi)待測樣 本的蛋白濃度調(diào)整在此線性范圍之內(nèi)。
[0020] D、測定精子唾液酸酶活性 (1)用檢測緩沖液將唾液酸酶標(biāo)準(zhǔn)原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的濃度梯 度將其稀釋為唾液酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，向檢測板內(nèi)依次加入各唾液酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液;加入待測樣 本于檢測板內(nèi)，再加入檢測緩沖液稀釋。
[0021] 唾液酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度根據(jù)精子唾液酸酶的表達(dá)量和本方法所能檢測到的靈敏 度而設(shè)定的。
[0022] 優(yōu)選地，所述的檢測板為96孔黑板，本發(fā)明采用巧光法來測定唾液酸酶的活性，黑 色的檢測板對靈敏度和特異性是最佳的，可W保護(hù)巧光染料不被光線澤滅，明顯降低光線 對巧光試劑澤滅的負(fù)面影響，從而使檢測的靈敏度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性得到大大提高。
[0023] (2)用檢測緩沖液稀釋巧光試劑，將其加入上述各唾液酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測樣本 的孔內(nèi)，再將檢測板置