>[0093] 所述的巧光試劑是y-4-甲基傘形酬基-a-D-N-乙酷神經(jīng)氨酸鋼。
[0094] 實(shí)施例15 一種精子質(zhì)量評(píng)估的方法，具體步驟如下： A、精子的洗涂 1. 新鮮液化精液標(biāo)本收集4-5ml (根據(jù)病人精子數(shù)量調(diào)整，冰上保存與運(yùn)輸）. 2. 加入等體積PBS，吹打均勻。
[00巧]3.低速離屯、（1500rcf/5min)，棄去上清液。
[0096] 4.加入PBS至3-4ml，吹打均勻。
[0097] 5.低速離屯、（150化cf/5min)，棄去上清液，將上清液剩至30化1左右，吹打均勻。
[0098] 6.加入PBS至1ml，高速離屯、(4度，12000巧m/5min)，盡可能棄去上清液。
[0099] B、提取精子蛋白 7. 向精子沉淀中加入2-3倍體積的裂解液和蛋白酶抑制劑cocktai 1 (終濃度為IX)，吹 打混勻，待無明顯的細(xì)胞沉淀即充分裂解，在4°C下高速離屯、（12000rpm/5min)，上清液即蛋 白提取物； C、測(cè)定精子蛋白提取物的蛋白濃度 8. 用裂解液配制BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液(20mg/ml)，取適量20mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液，用裂 解液按2/1.0/0.5/0.25/0.125/Omg/ml的濃度梯度將其稀釋為蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，向96孔透明 板內(nèi)依次加入20μ1各蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0100] 9.力日2微升待測(cè)樣本于96孔板內(nèi)，加裂解液至20微升。
[0101] 10.按A: Β=50:1的體積比配制試劑A液和Β液的混合液(室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定），將其 加入上述各孔，200微升/孔。
[0102] 11.輕輕混勻30s，將96孔透明板置于37度反應(yīng)30min，然后用酶標(biāo)儀在562皿波長 下讀取各孔吸光度，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣本的蛋白濃度。
[0103] 用于檢測(cè)的孔內(nèi)樣本蛋白濃度應(yīng)在0.1-2mg/ml范圍內(nèi)，如果超出則應(yīng)將孔內(nèi)待測(cè) 樣本的蛋白濃度調(diào)整在此線性范圍之內(nèi)。
[0104] D.測(cè)定精子唾液酸酶活性 1.用檢測(cè)緩沖液將唾液酸酶標(biāo)準(zhǔn)原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的濃度梯 度將其稀釋為唾液酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，向96孔黑板內(nèi)依次加入50μ1各唾液酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0105] 2.加25微升待測(cè)樣本于96孔黑板內(nèi)，加檢測(cè)緩沖液至50微升。
[0106] 3.用檢測(cè)緩沖液按1:200稀釋巧光試劑，將其加入上述各孔內(nèi)，50微升/孔。
[0107] 4.將96孔黑板置于37度避光解育1-2小時(shí)，然后用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長/發(fā)射波長 為365/450nm波長下讀取各孔巧光強(qiáng)度，根據(jù)唾液酸酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣本的唾 液酸酶活性。
[0108] 5.最后將得到的唾液酸酶活性/總蛋白濃度，計(jì)算得出單位酶活值（U AUS/g protein)即可。
[0109] 用于檢測(cè)的孔內(nèi)樣本唾液酸酶活性應(yīng)在0.3-5mU/ml范圍內(nèi)，如果超出則應(yīng)將孔內(nèi) 待測(cè)樣本的唾液酸酶活性值調(diào)整在此線性范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種精子質(zhì)量評(píng)估的方法，其特征在于:具體步驟如下： A、 精子的洗滌 收集新鮮液化精液標(biāo)本，用磷酸緩沖液或者BWW培養(yǎng)液洗滌精子，充分除去殘留的精漿 成分，再離心分離出精子； B、 提取精子蛋白 向A步驟分離出的精子中加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑cocktail，混勾，待無明顯的 細(xì)胞沉淀即充分裂解，在4°C下高速離心，上清液即蛋白提取物； C、 測(cè)定精子蛋白提取物的蛋白濃度 (1) 用細(xì)胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液，再用裂解液按2/1.0/0.5/0.25/ 0.125/0mg/ml的濃度梯度將蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液稀釋為蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，向檢測(cè)板內(nèi)依次加入各蛋 白標(biāo)準(zhǔn)溶液;加入待測(cè)樣本于檢測(cè)板內(nèi)，再加入裂解液稀釋； (2) 按A: B=50:1的體積比配制試劑A液和B液的混合液，將其加入上述各蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液 和待測(cè)樣本的孔內(nèi)，輕輕混勻，將檢測(cè)板置于37°C反應(yīng)30min，然后用酶標(biāo)儀讀取各孔吸光 度，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣本的蛋白濃度； D、 測(cè)定精子唾液酸酶活性 (1) 用檢測(cè)緩沖液將唾液酸酶標(biāo)準(zhǔn)原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的濃度梯 度將其稀釋為唾液酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液，向檢測(cè)板內(nèi)依次加入各唾液酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液;加入待測(cè)樣 本于檢測(cè)板內(nèi)，再加入檢測(cè)緩沖液稀釋； (2) 用檢測(cè)緩沖液稀釋熒光試劑，將其加入上述各唾液酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)樣本的孔 內(nèi)，再將檢測(cè)板置于37°C避光孵育1-2小時(shí)后，用酶標(biāo)儀讀取各孔熒光強(qiáng)度，根據(jù)唾液酸酶 活性標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/蛋白濃度的值即 可。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精子質(zhì)量評(píng)估的方法，其特征在于：所述的試劑A液為： 1 % BCA二鈉鹽，2 %無水碳酸鈉，0.16%酒石酸鈉，0.4 %氫氧化鈉，0.95 %碳酸氫鈉，混合調(diào) pH值至11.2-11.3;試劑B液為:4 %硫酸銅。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精子質(zhì)量評(píng)估的方法，其特征在于:所述的檢測(cè)緩沖液為 含0.05 mmol/1乙酸鈉和0.25yg/yl牛血清白蛋白的磷酸緩沖液。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種精子質(zhì)量評(píng)估的試劑盒，其特征在于:所述乙酸鈉的pH值 為 5-6〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精子質(zhì)量評(píng)估的方法，其特征在于:所述的唾液酸酶標(biāo)準(zhǔn) 原液為產(chǎn)氣莢膜梭菌唾液酸酶，濃度為5U/ml。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精子質(zhì)量評(píng)估的方法，其特征在于：所述的熒光試劑是 2?-甲基傘形酮基-α-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精子質(zhì)量評(píng)估的方法，其特征在于:所述B步驟的細(xì)胞裂 解液不含酶活抑制劑，加入體積為精子體積的2-3倍。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精子質(zhì)量評(píng)估的方法，其特征在于:所述的C步驟，用細(xì)胞 裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液的濃度為20mg/ml。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精子質(zhì)量評(píng)估的方法，其特征在于:所述的C步驟，酶標(biāo)儀 在562nm波長下讀取各孔吸光度。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精子質(zhì)量評(píng)估的方法，其特征在于:所述C步驟的檢測(cè)板 為96孔透明板，所述D步驟的檢測(cè)板為96孔黑板。11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精子質(zhì)量評(píng)估的方法，其特征在于:所述的D步驟，用檢 測(cè)緩沖液稀釋至熒光試劑的濃度為〇. 〇5mM。12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種精子質(zhì)量評(píng)估的方法，其特征在于:所述的D步驟，酶標(biāo) 儀在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為365nm和450nm的波長下讀取各孔熒光強(qiáng)度。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種精子質(zhì)量評(píng)估的方法。具體步驟如下：A、收集新鮮液化精液標(biāo)本，用磷酸緩沖液或者BWW培養(yǎng)液洗滌精子，充分除去殘留的精漿成分，再離心分離出精子；B、向A步驟分離出的精子中加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑cocktail，混勻，待無明顯的細(xì)胞沉淀即充分裂解，在4℃下高速離心，上清液即蛋白提取物；C、測(cè)定精子蛋白提取物的蛋白濃度；D、測(cè)定精子唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/蛋白濃度的值即可。通過精子中唾液酸酶活性的檢測(cè)，為臨床原因不明的男性不育患者提供診斷依據(jù)及臨床咨詢。
【IPC分類】C12Q1/34
【公開號(hào)】CN105671126
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610147267
【發(fā)明人】馬芳, 馬學(xué), 李福平
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)華西第二醫(yī)院
【公開日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年3月16日