一種新的eb病毒ebna1表位肽及其在ebv相關(guān)疾病的診斷、治療和預(yù)防中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及免疫治療領(lǐng)域，具體設(shè)及一種新的EB病毒EBNAl表位膚及其在EBV相關(guān) 疾病的診斷、治療和預(yù)防中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] EBV化pstein-Barr virus，EB病毒）是Epstein和Barr于 1964年首次成功地將 Burkitt非洲兒童淋己瘤細(xì)胞通過(guò)體外懸浮培養(yǎng)而建株，并在建株細(xì)胞涂片中用電鏡觀察 到的瘤疹病毒顆粒。EBV屬于瘤疹病毒丫亞科，EBV在人群中廣泛感染，根據(jù)血清學(xué)調(diào)查，大 多數(shù)人幼兒時(shí)期就已經(jīng)感染，在發(fā)展中國(guó)家健康成年人中，EBV感染比率超過(guò)90%，感染后 終身潛伏。在絕大多數(shù)情況下，病毒感染后并無(wú)明顯癥狀，只有極少數(shù)情況下會(huì)引起如傳染 性單核細(xì)胞增多癥等急性癥狀。目前認(rèn)為，EBV感染與非洲兒童Burkitt淋己瘤、鼻咽癌、淋 己瘤W及各種免疫抑制劑治療患者和器官移植患者的淋己細(xì)胞增生素亂綜合癥等密切相 關(guān)。其中，淋己瘤和鼻咽癌是與邸V關(guān)系最為密切的兩種惡性腫瘤，另外約8-10%的胃癌也 與邸V相關(guān)。
[0003] EBV引起的疾病和造成的死亡呈現(xiàn)明顯的地域性特點(diǎn)。東亞地區(qū)邸V相關(guān)死亡人數(shù) 居世界之首，約占全球邸V相關(guān)死亡人數(shù)的一半W上。造成運(yùn)一現(xiàn)象的因素中，遺傳和病毒 亞型的分布差異是其中重要的因素。
[0004] 邸NAl是邸V處于各階段隱匿狀態(tài)時(shí)，都始終表達(dá)的病毒蛋白，對(duì)于病毒基因組在 宿主細(xì)胞的存在具有至關(guān)重要的作用。根據(jù)邸V不同基因的多態(tài)性，EBV可分為不同亞型。其 中，根據(jù)邸NAl蛋白第487位氨基酸及相鄰幾個(gè)氨基酸殘基的差異，可W將邸V分為5種亞型， 分別為口-曰1曰、口-地1'、￥-￥曰1、￥-1611和￥-口1'〇。經(jīng)調(diào)查，五種?。喰统尸F(xiàn)出明顯的地域流行差 異，其中，P-t虹主要流行于歐美地區(qū)，而東亞地區(qū)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位的為V-val亞型。具體的， 分別從丹麥和中國(guó)人鼻咽癌和霍奇金淋己瘤中分離得到的EBV中，丹麥人中近75%為P-t虹，而中國(guó)人75%為V-val。日本學(xué)者也得到相似的結(jié)果。在邸V相關(guān)性胃癌的研究中，美國(guó) 地區(qū)分離的病毒超過(guò)50 %為P-t虹，而從日本地區(qū)分離到的無(wú)一例外均為V-val亞型。
[0005] 與其它亞型相比較，V-val亞型邸V在多項(xiàng)研究中表現(xiàn)出更強(qiáng)的致瘤能力。V-val亞 型EBNAl基因轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，較B95-8原型表現(xiàn)出更強(qiáng)的克隆形成能力，和對(duì)低血清的耐 受。
[0006] 由于東亞地區(qū)V-val亞型EBV的絕對(duì)流行優(yōu)勢(shì)，因此，在應(yīng)用疫苗或過(guò)繼性細(xì)胞治 療時(shí)，必須充分考慮到該地區(qū)EBV流行情況。即在東亞地區(qū)，應(yīng)WV-val亞型邸NAl序列作為 抗原進(jìn)行相應(yīng)的設(shè)計(jì)。而目前發(fā)現(xiàn)的EBNAl表位，絕大多數(shù)都來(lái)源于B95-8病毒株，即P-ala 亞型。因此，目前已發(fā)現(xiàn)的表位并不能完全適用于東亞地區(qū)V-val亞型邸V相關(guān)性疾病的免 疫預(yù)防和治療。目前迫切需要發(fā)現(xiàn)新的安全性高且特異性高的V-val亞型EBV的邸NAl表位 膚可用于預(yù)防和治療邸V相關(guān)疾病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題提出的。
[0008] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0009] 本發(fā)明第一目的為提供一種新的EB病毒EBNAl表位膚，其在HLA-A限制性條件下被 CD8+淋己細(xì)胞特異性識(shí)別，其氨基酸序列為GIALAVPQC。
[0010] 優(yōu)選的，所述的EBNAl為V-val亞型EB病毒EBNAl，所述的HLA-A限制性是HLA-A* 0201限制性。
[0011] 本發(fā)明第二目的為提供一種制備對(duì)EBNAl具有特異性反應(yīng)的T淋己細(xì)胞的方法，包 括W下步驟：
[0012] a將起始細(xì)胞與權(quán)利要求1或2所述新的邸病毒邸NAl表位膚在抗原提呈細(xì)胞存在 的條件下在培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，獲得含有特異性反應(yīng)的T淋己細(xì)胞的免疫細(xì)胞培養(yǎng)物;和
[0013] b分離發(fā)生特異性反應(yīng)的T淋己細(xì)胞;其中，所述T淋己細(xì)胞為CD8巧淋己細(xì)胞。
[0014] 優(yōu)選的，所述起始細(xì)胞為人外周血單個(gè)核細(xì)胞。
[0015] 優(yōu)選的，所述起始細(xì)胞為從人外周血單個(gè)核細(xì)胞中分離的CD8巧淋己細(xì)胞。
[0016] 優(yōu)選的，所述特異性反應(yīng)包括分泌化1類細(xì)胞因子。
[0017] 優(yōu)選的，所述化1類細(xì)胞因子選自IFN-丫、比-2、TNF-a和比-8等。
[0018] 優(yōu)選的，分離發(fā)生特異性反應(yīng)的T淋己細(xì)胞，其特異性識(shí)別權(quán)利要求1或2的EBNAl 表位膚，并能夠在識(shí)別后發(fā)生特異性反應(yīng)。
[0019] 優(yōu)選的，所述能夠在識(shí)別后發(fā)生特異性反應(yīng)中的特異性反應(yīng)包括分泌化1類細(xì)胞 因子。
[0020] 優(yōu)選的，所述Thl類細(xì)胞因子選自IFN-丫、IL-2、TNF-a和IL-8等。
[0021] 本發(fā)明第S目的為提供一種上述新的邸病毒EBNAl表位膚在制備用于預(yù)防和/或 治療邸V相關(guān)疾病的藥物組合中的用途。
[0022] 優(yōu)選的，所述藥物組合物還包括藥物學(xué)可接受的載體。
[0023] 本發(fā)明第四目的為提供一種用于診斷、預(yù)防和/或治療EBV相關(guān)疾病的試劑、藥物 和疫苗，包括上述的新的邸病毒邸NAl表位膚和佐劑。
[0024] 本發(fā)明提供的新的邸病毒邸NAl表位膚及其在邸V相關(guān)疾病的診斷、治療和預(yù)防中 的用途具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0025] 由于V-val亞型邸病毒在中國(guó)地區(qū)處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的流行地位，多種邸V相關(guān)疾病均 與運(yùn)一病毒亞型相關(guān)，包括NK/T細(xì)胞淋己瘤、嗜血細(xì)胞綜合癥等。運(yùn)類疾病目前的治療效果 差，預(yù)后不佳。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了V-val亞型EB病毒中，一種新的EBNAl表位，具體為V-val亞型 邸NAl中HLA-A*0201限制性表位，可W在體外刺激PBMC產(chǎn)生邸NAl特異性反應(yīng)，如IFN- 丫的 分泌等。運(yùn)一表位與P-ala亞型對(duì)應(yīng)序列相比較，與HLA-A*0201分子有著更強(qiáng)的親和力。運(yùn) 一發(fā)現(xiàn)為中國(guó)，W至東亞地區(qū)EBV相關(guān)疾病的預(yù)防和治療，尤其是免疫治療方法，提供了有 力的幫助，具有重大的應(yīng)用價(jià)值和意義。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為EBNAl重疊膚混合物刺激不同健康人PBMC產(chǎn)生膚反應(yīng)性T細(xì)胞的特異性反應(yīng) 圖；
[0027]圖2為來(lái)源于健康供者A012的膚反應(yīng)性單克隆細(xì)胞分別對(duì)SEQ ID NO:2-18膚段的 反應(yīng)性；
[00%]圖3為來(lái)源于健康供者A021的膚反應(yīng)性單克隆細(xì)胞分別對(duì)SEQ ID NO: 1-18膚段的 反應(yīng)性；
[0029] 圖4為來(lái)源于健康供者A024的膚反應(yīng)性單克隆細(xì)胞分別對(duì)SEQ ID NO:2-18膚段的 反應(yīng)性；
[0030] 圖5為用SEQ ID NO 17膚段單獨(dú)刺激產(chǎn)生膚反應(yīng)性T細(xì)胞的特異性反應(yīng)圖；
[0031] 圖 6 為膚反應(yīng)性 T 細(xì)胞對(duì) EV01-01、EV01-02、EV01-03、EV01-04 和 EV01-05 運(yùn) 5 條膚段 進(jìn)行驗(yàn)證的反應(yīng)結(jié)果圖；
[0032] 圖7為EV01-02刺激效應(yīng)細(xì)胞大量分泌IFN- 丫的反應(yīng)圖；
[0033] 圖8為9aa長(zhǎng)表位序列的確認(rèn)反應(yīng)圖；
[0034] 圖9為不同人來(lái)源LCL荷載表位后對(duì)A021效應(yīng)細(xì)胞的刺激作用結(jié)果圖；
[00巧]圖10為V-val亞型表位和P-ala亞型對(duì)應(yīng)序列誘導(dǎo)的特異性T細(xì)胞分泌IFN- 丫的能 力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 為了使本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，W下結(jié)合 附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用W 解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0037] 本發(fā)明提供一種新的邸NAl表位膚，其氨基酸序列為GIALAVPQC。
[003引具體的，所述邸NAl為V-val亞型邸病毒邸NAl，所述邸NAl表位膚為新的MHC-I類限 制性表位膚，其能在化A-A限制性條件下被CD8巧淋己細(xì)胞特異性識(shí)別，具體的，本發(fā)明的 邸NAl表位膚為HLA-A*0201限制性表位膚。
[0039] 本文中"表位膚"指包含抗原表位，在特定MH邱良制性條件下能引起免疫反應(yīng)的多 膚或膚段?？赏ㄟ^(guò)商業(yè)定制的化學(xué)合成等任何已知的制備多膚的方法獲得本發(fā)明的表位 膚。優(yōu)選的，本發(fā)明表位膚獲得方法是商業(yè)定制的化學(xué)合成(上海吉爾生化有限公司）。
[0040] 本發(fā)明提供了一種制備對(duì)邸NAl具有特異性反應(yīng)的CD8巧淋己細(xì)胞的方法，包括W 下步驟：
[0041 ] a將起始細(xì)胞與本發(fā)明的邸NAl表位膚在抗原提呈細(xì)胞存在的條件下在培養(yǎng)基中 共培養(yǎng)，獲得含有特異性反應(yīng)的T淋己細(xì)胞的免疫細(xì)胞培養(yǎng)物;和
[0042] b分離具有特異性反應(yīng)的T淋己細(xì)胞。
[0043]