本培養(yǎng)方法中所述起始細(xì)胞為外周血液單核細(xì)胞、或從外周血液單核細(xì)胞中分離 的CD8+T淋己細(xì)胞。起始細(xì)胞可選自：外周血液單核細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、造血前趨細(xì)胞或干細(xì)胞 的任意一種或多種、或它們的衍生細(xì)胞。優(yōu)選的，抗原提呈細(xì)胞包括能夠?qū)⒖乖岢手罷淋 己細(xì)胞的任何細(xì)胞。
[0044] 本培養(yǎng)方法中培養(yǎng)基可為培養(yǎng)適于淋己細(xì)胞的任何培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過程中需加入 細(xì)胞因子，可根據(jù)需要優(yōu)化細(xì)胞因子的量，優(yōu)選的加入IL-2、比-7的組合，使得培養(yǎng)得到的 CTLs中含有更多的抗原具有免疫應(yīng)答反應(yīng)的細(xì)胞。
[0045] 本培養(yǎng)方法中的共培養(yǎng)，為了增加對淋己細(xì)胞的刺激，可W重復(fù)加入荷載本發(fā)明 邸NAl表位膚的抗原提呈細(xì)胞。優(yōu)選的，一次刺激，共培養(yǎng)1W。
[0046] 本培養(yǎng)方法中獲得的特異性反應(yīng)包括分泌化1類細(xì)胞因子，選自IFN-丫、化-2、 TNF-a和IL-8。需對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行此類細(xì)胞因子檢測，確定其有特異性細(xì)胞，再對此特定的 細(xì)胞因子分離具有特異性反應(yīng)的T淋己細(xì)胞。優(yōu)選的，分離特異性分泌IFN- 丫的細(xì)胞。
[0047] 本培養(yǎng)方法中分離具有特異性反應(yīng)的T淋己細(xì)胞的方法還可W通過有限稀釋法進(jìn) 一步獲得對邸NAl表位膚有特異性反應(yīng)的單克隆細(xì)胞。
[0048] 本發(fā)明還由此提供了對EBNAl具有特異性反應(yīng)的T淋己細(xì)胞在EBV相關(guān)疾病的診 斷、治療和/或預(yù)防中的用途。所述EBV引發(fā)的疾病包括鼻咽癌、慢性活動(dòng)性EBV感染、嗜血細(xì) 胞綜合癥、造血干細(xì)胞移植或器官移植后邸V感染、淋己增殖性疾病、W及與邸V高度相關(guān)的 淋己瘤和胃癌。
[0049] 最后本發(fā)明還提供了本發(fā)明的邸NAl表位膚用于預(yù)防和/或治療邸V相關(guān)疾病的疫 苗及其佐劑。所述疫苗可W在體內(nèi)刺激產(chǎn)生識(shí)別EBNAl抗原，并產(chǎn)生特異性細(xì)胞，W此預(yù)防 和/或治療EBV相關(guān)疾病。本發(fā)明的EBNAl表位膚還可W用于EBV疫苗的制備，也可應(yīng)用于 Tetramer等試劑的制備，用于健康人或相關(guān)患者對邸NAl特異性細(xì)胞免疫水平的評價(jià)。
[0050] 本發(fā)明邸NAl表位膚用于在EBV相關(guān)疾病的診斷、治療和/或預(yù)防中，對腫瘤病理組 織樣本檢測為V-val亞型邸病毒陽性受試者施用。
[0化1 ] 實(shí)驗(yàn)例
[0052] 一、實(shí)驗(yàn)材料及儀器
[0化3] AIM V培養(yǎng)基；
[0化4] 重組人IL-7;
[0化日]注射用人重組IL-2;
[0056] PBS，不含巧、儀離子，細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)；
[0057] 邸NA-IC端序列，20aa重疊膚段；
[005引系列截短膚段；
[0059] DMSO；
[0060] Human IFN-丫化ISA IQT 96T;
[0061] IFN-丫secretion assay cell enrich detect kit；
[0062] Mitomycin C，即：絲裂霉素 C;
[0063] PHA，即：植物血凝素；
[0064] BD Cytofix/Cytoperm? Plus Fixation/Permeabilization Kit [00化]生理鹽水；
[0066] 各類巧光標(biāo)記抗體
[0067] 離屯、機(jī)；
[006引旋轉(zhuǎn)混勻器；
[0069] 流式細(xì)胞儀；
[0070] 顯微鏡。
[0071] 二、實(shí)驗(yàn)步驟及方法
[0072] 步驟1、候選表位膚的設(shè)計(jì)與合成
[0073] W中國人最常見化A等位基因化LA-A、B和DR位點(diǎn)）為條件，利用生物信息學(xué)方法， 設(shè)計(jì)和合成一系列約20氨基酸殘基的多膚，運(yùn)些多膚相互重疊，涵蓋了 EBNAl分子中最有可 能的免疫表位存在區(qū)域。
[0074] 參見表1，為設(shè)計(jì)和合成的18個(gè)膚段的膚序列號(hào)、W及每個(gè)膚段的氨基酸序列。在 表1中，SEQ ID NO :1-15的膚段來源于邸NA1B95-8病毒株，每個(gè)寡膚長約20個(gè)氨基酸，相鄰 兩個(gè)膚段重疊10個(gè)氨基酸，覆蓋EBNAl蛋白中從第470個(gè)氨基酸到第610個(gè)氨基酸的范圍； SEQ ID NO: 16-18的膚段來源于中國廣東地區(qū)分離到的GDl病毒株。
[0075] 表 1
[0078] 采用密度梯度離屯、法，分離健康供者的肝素抗凝全血中的PBMC(外周血單個(gè)核細(xì) 胞)。
[0079] 簡單操作步驟如下：將健康供者的肝素抗凝全血加載到Ficoll表面，900g離屯、 20min后，用移液管吸取白膜細(xì)胞層，將其用PBS洗涂兩次，并用細(xì)胞篩網(wǎng)去除其中的細(xì)胞團(tuán) 塊，計(jì)數(shù)備用。
[0080] 步驟3、用重疊膚混合物抗原刺激培養(yǎng)邸V-CTLs細(xì)胞
[0081] 將步驟1合成得到的18種膚段按等摩爾濃度混合，得到重疊膚混合物，再將重疊膚 混合物的濃度配制為2mM。
[0082] 用培養(yǎng)基將步驟2分離得到的PBMC細(xì)胞密度調(diào)整為1 X lOVml，Wl: 1000體積比加 入重疊膚混合物，充分吹打混勻后，37°C下解育30min;
[0083] 用PBS洗涂兩次后，用培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為lX10Vml，加入Iレ2100U/ml、Iレ 720ng/ml，混勻后接種入96孔U底板中，每孔20化l，每隔2-3天換液一次，并補(bǔ)充細(xì)胞因子和 培養(yǎng)基，共培養(yǎng)一周。
[0084] 步驟4、邸V-CTLs特異性檢測
[0085] 取步驟4得到的細(xì)胞懸液若干，分別加入=支細(xì)胞培養(yǎng)管中，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)管補(bǔ)充 培養(yǎng)基至1ml。其中一管加入重疊膚混合物，一管加入PMA化1，離子霉素化1作為陽性對照， 另一管加入DMSO作為陰性對照;再在每管分別加入Golgistop(莫能菌素)0.7iU。在37°C下、 5 % C〇2條件下培養(yǎng)4小時(shí)。
[00化]用PBS洗涂細(xì)胞一次，加入PC5-CD4、陽-CD3、P口-CD8等細(xì)胞表面巧光標(biāo)記抗體，2-8°C下解育30min;用PBS洗涂細(xì)胞一次，破膜固定細(xì)胞后，加入FITC-IFN-丫，再次2-8°C下避 光解育30min;破膜洗涂液洗涂細(xì)胞兩次后，重懸細(xì)胞，檢測總細(xì)胞中CD3+IFN- 丫 +細(xì)胞比例。
[0087] 用步驟1中設(shè)計(jì)合成的邸NAl重疊膚混合物刺激不同健康人PBMC，結(jié)果如圖1所示， 表明邸NAl重疊膚混合物可W刺激不同健康人PBMC產(chǎn)生膚反應(yīng)性T細(xì)胞，即邸V-CTLs。
[0088] 步驟5、膚反應(yīng)性T細(xì)胞的分離
[0089] 按IFN-丫 secretion assay cell enrich detect kit說明書操作，從步驟4得到 的總細(xì)胞中分離發(fā)生特異性反應(yīng)的膚反應(yīng)性T細(xì)胞。
[0090] 具體分離方法簡單介紹如下：在待分離細(xì)胞中加入抗原或相應(yīng)刺激劑，培養(yǎng) 3hrl5min。預(yù)冷液體洗涂一次后，加入IFN- 丫捕獲試劑，冰上解育5min后，加入預(yù)溫至37°C 的培養(yǎng)基，并旋轉(zhuǎn)混懸培養(yǎng)45min。預(yù)冷緩沖液洗涂細(xì)胞一次，加入IFN- 丫檢測抗體。E標(biāo) 記)混勻，冰上解育lOmin。再次洗涂一次，加入抗PE抗體標(biāo)記微珠，充分混勻后4-8°C解育 15min，洗涂重懸細(xì)胞。用分離柱獲取結(jié)合于柱上的細(xì)胞部分，即分離得到膚反應(yīng)性T細(xì)胞。 [0091 ]步驟6、有限稀釋法獲得單克隆膚反應(yīng)性細(xì)胞
[0092] 用2-3人外周血單個(gè)核細(xì)胞混合作為飼養(yǎng)細(xì)胞，用Mito町Cin C處理飼養(yǎng)細(xì)胞 30min，洗涂細(xì)胞一次，用培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至lOVml，加入PHA至終濃度為化g/ml，比-2至200U/ml，接種入96孔U底板。將步驟5分離得到的膚反應(yīng)性T細(xì)胞稀釋至10個(gè)/ml，也加入 96孔U底板中。5%二氧化碳，37°C培養(yǎng)1周。1周后觀察各孔中細(xì)胞生長情況，判斷有無細(xì)胞 克隆形成。有細(xì)胞生長的孔可待細(xì)胞長滿后，將培養(yǎng)物擴(kuò)增培養(yǎng)，直至滿足需要和保存。
[0093] 將有細(xì)胞克隆形成的孔中的內(nèi)容物完全吸出，經(jīng)處理獲得單克隆或多克隆膚反應(yīng) 性細(xì)胞。
[0094] 步驟7、單克隆或多克隆細(xì)胞對膚段特異性檢測
[00M]取生長狀態(tài)良好的單克隆或多克隆細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至1.5-2 X IO5Ail，接種入96孔板中，加入待測膚段。其中一孔中加入IOOiil培養(yǎng)基作為空白對照。37 °C，5%C02條件下培養(yǎng)過夜。按相應(yīng)IFN- 丫化ISA檢測試劑盒說明，檢測培養(yǎng)上清中IFN- 丫 含量。
[0096] 用步驟1中設(shè)計(jì)合成的邸NAl重疊膚混合物刺激不同健康人PBMC，分別對多克隆細(xì) 胞進(jìn)行膚段特異性檢測，所加入的待測膚段分別為步驟1合成得到的18個(gè)膚段W及步驟3得 到的重疊膚混合物。
[0097] 檢測結(jié)果如圖2、圖3和圖4所示，其中，圖2為來源于健康供者A012的膚反應(yīng)性單克 隆細(xì)胞分別對SEQ ID NO: 2-18膚段的反應(yīng)性；圖3為來源于健康供者A021的膚反應(yīng)性單克 隆細(xì)胞分別對SE