24株于田間，全部取樣并提取DNA，用 qWS8Flanking-Rl擴增，尋找基因型為雜合單株，對雜合單株DNA再用30677 (或位點特異性 引物）進行鑒定，確保qWS8存在，對其中一株單株收種，編號為BC3F5-NIL。
[01巧](9)依照8步驟的方法，繼續(xù)進行了兩代鑒定和收種，分步獲得BC3F6-NIL和 BC3巧-N比，將BC3F7-NIL種植24株于田間，全部取樣并提取DNA，用30677引物（或位點 特異性引物）進行基因型鑒定，將包含qWS8位點單株找出，然后對運些單株DNA用SNP3引 物繼續(xù)擴增鑒定，挑選出qWS8位點純和的單株，選取其中一株收種并編號為NIL-WS3(即 Ni 1-WS3A1 Ieles)，而其中雜合單株即為NIL-Hetero Alleles。從不包含qWS8位點的單株 中選取一株收種并編號為NIL-NIP (即Nil-Nip Alleles)。至此近等基因系發(fā)展完成，包 含一段約80化的qWS8位點導(dǎo)入片段。ZS97背景NIL采用類似方式獲得，見下方"7"的方 法。
[0156] 6、NIP背景下qWS8位點與qPL6位點聚合單株產(chǎn)生
[0157] 步驟同利用qWS8位點進行粗桿大穗品系發(fā)展步驟類似，具體修改細節(jié)如下：
[015引步驟（1)，似：同上述"4"中的步驟（1)，似。
[0159] (3)由于qPL6和qWS8位于不同的染色體上，故需要增加種植株數(shù)至48株W確保 獲得足夠數(shù)目雙位點單株，在鑒定時除了使用30677標(biāo)記（或位點特異性引物），還需要使 用qPL6連鎖標(biāo)記460dCapsl和480dCapsl (表1)進行基因型鑒定，包括PCR擴增，酶切，3% 凝膠電泳，表現(xiàn)為雜合的單株（兩條帶）即包含qPL6位點，將同時具備qPL6和qWS8的單 株BClFl單株與NIP雜交，成熟后收種，編號為BC2F1。
[0160] (4)~妨在下一季繼續(xù)種植，依此方法，進一步獲得BC3F1單株和BC4F1單株，用 上述S對標(biāo)記篩選出BC4F1單株中包含qWS8位點和qPL6位點的單株，收種，編號為BC4F2。 [016。 （6)在下一季將BC4F2種子種植48株于田間，對qWS8位點，需要使用30677 (或位 點特異性引物）和SNP3引物確定qWS8位點存在且基因型為雜合（SNP3呈現(xiàn)兩條帶），而對 qPL6位點，則用460dCapsl和480dCapsl引物進行鑒定，篩選雜合基因型（兩條帶），依次 方法，找到同時包含qWS8和qPL6基因型為雜合的單株，挑選其中一株，收種，編號為BC4F3。
[0162] (7)同步驟6,將BC4F3播種，鑒定后得到BC4F4種子。
[016引 做將BC4F4播種96株，全部提DNA，用qWS8引物30677(或位點特異性引物）和 SNP3和qPL6引物460dCapsl和480dCapsl對所有單株進行基因型鑒定，同時擴增雙親DNA， 尋找四個引物擴增條帶都與WS3 -致的單株，即為qWS8與qPL6的聚合單株，對應(yīng)圖17中 的4株系，而qWS8引物帶型與WS3 -致，qPL6引物帶型與NIP -致的為只包含qWS8位點 單株，對應(yīng)圖17中的3株系，qWS8帶型與NIP-致，而qPL6帶型與WS3 -致單株對應(yīng)圖17 中的2株系，所有帶型都與NIP -致的對應(yīng)圖17中的1株系。至此聚合株系4發(fā)展完成， 其附帶株系2和3也表現(xiàn)為增產(chǎn)潛力（圖17)。
[0164] 7、利用qWS8位點發(fā)展ZS97背景近等基因系
[0165] ZS97背景下近等基因系發(fā)展步驟同與NIP背景下近等基因系發(fā)展步驟類似，具體 細節(jié)如下：
[0166] (1)~（5)步驟同NIP背景發(fā)展步驟，但需要將其中NIP親本換成ZS97, ZS97花 期較NIP還早，所W ZS97可W晚兩周種植，然后間隔屯天種植四批。
[0167] (6)將ZS97BC3F2種子種植600株，全部取樣并提取DNA，然后利用覆蓋qWS8范 圍更大的分子標(biāo)記進行PCR擴增，然后3%瓊脂糖凝膠電泳，標(biāo)記為qWS8Flanking-L2和 qWS8Flanking-R3 (表 2)，同時擴增雙親 DNA(WS3 和 ZS97)，挑選 qWS8Flanking-L2 帶型與 ZS97 -致，而qWS8Flanking-R3帶型為雜合（兩條帶）的單株，然后對運些單株DNA繼續(xù)用 30677標(biāo)記篩選，挑選其中一株qWS8位點存在的單株收種，編號為ZS97BC3F3。
[0168] (7)在下一季將ZS97BC3F3種植24株于田間，取樣提DNA，用30677引物（或位 點特異性引物）進行基因型鑒定，將包含qWS8位點單株找出，然后對運些單株DNA用SNP3 引物繼續(xù)擴增鑒定，挑選出qWS8位點純和的單株，選取其中一株收種并編號為NIL-WS3， 對應(yīng)雜合單株即為NIL-Hetero,而從不包含qWS8位點的單株中選取一株收種并編號為 NIL-ZS97,至此ZS97背景近等基因系發(fā)展完成，由于沒有繼續(xù)篩選右側(cè)交換標(biāo)記，故近等 基因系包含片段較大，但運并未影響qWS8在ZS97背景下對莖粗和穗大小的促進效應(yīng)（圖 14)，如需繼續(xù)篩選可繼續(xù)將本步驟中qWS8位點存在，且SNP3為雜合的單株再下一季繼續(xù) 種植約200株，取樣提DNA用SNP3引物和qWS8Flanking-R3引物進行擴增，同時擴增雙親 DNA，尋找SNP3雜合而qWS8Flanking-R3帶型與ZS97 -致的個體，然后用30677 (或位點特 異性引物）擴增，確保qWS8存在，所得單株收種，下一季繼續(xù)種植，再進行30677 (或位點特 異性引物）和SNP3引物鑒定，篩選出包含qWS8區(qū)間更小的NIL-WS3和N比-ZS97。
[0169] 表2、用于近等基因系構(gòu)建篩選交換引物
[0170]
[0171] 8、DNA印跡雜交及位點特異性PCR檢測
[0172] DNA印跡雜交需要高質(zhì)量的DM,故該鑒定方法中使用的DNA采用CTAB法提取。根 據(jù)定位區(qū)間的序列特征，選取了一系列酶（Fermentas公司）（如圖5所示）對雙親DNA進 行單酶切或雙酶切消化，酶切體系為400ul，包含20ug DNA，40ul 10 X緩沖液，20ul酶，然 后用水補齊至400ul。酶切條件為37°C，24小時，其中IOul酶為酶切過夜后補加，W確保 酶切完全。酶切完全后，加等體積酪氯仿抽提，離屯、后吸上清，加兩倍體積預(yù)冷無水乙醇及 1/10體積3M醋酸鋼沉淀一段時間后離屯、，倒掉再用70%乙醇洗后即可獲得酶切產(chǎn)物，干燥 后用40ul TE buffer溶解。然后進行1%濃度的瓊脂糖膠電泳，電壓30V，電泳時間10-12小 時。電泳完成后，對瓊脂糖膠進行0. 25M鹽酸，變性液及中和液處理后即可轉(zhuǎn)膜，所使用膜 為尼龍膜，轉(zhuǎn)膜液為20 X SSC，采用濾紙自然吸附法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜裝置安放順序為：轉(zhuǎn)膜槽，濾 紙橋，兩層12 X 12濾紙，瓊脂糖膠，一張經(jīng)過水和SSC浸泡過的12 X 12尼龍膜，兩層12 X 12 濾紙，大量12X12吸水紙，重物。其中吸水紙要每隔一段時間換一次，轉(zhuǎn)膜14-16個小時。 將所轉(zhuǎn)膜用5 X SSC清洗，然后采用羅氏地高辛系統(tǒng)進行探針及雜交液制備，然后在雜交爐 中進行探針雜交過夜，探針標(biāo)記及其后步驟參考羅氏地高辛標(biāo)記試劑盒說明書（PCR DIG Probe Synthesis Kit 和 DIG DNA Labeling and Detection Kit)。
[0173] 其中圖5所示探針（Probe)引物為：
[0174] MDTl :5, -AGGGTTGTACCACTGGTAAA-3'（沈Q ID N0:2)，
[01巧]5, -CCATCGTCGGAAAGGGATTT-3,（沈Q ID N0:3);
[0176] MDT3L1 :5, -CCAACCCCCCCTCCCAA-3'（SEQ ID N0:4)，
[0177] 5' -ACGCTGACGCCCTCTCCCT-3'（沈Q ID N0:5);
[0178] MDT3 :5, -GACCTGCCTCCAGTTATCAA-3'（沈Q ID N0:6)，
[0179] 5' -CTTCTCCACCAACATTCTTT-3'（沈Q ID N0:7);
[0180] MDT7 :5' -GGTTTAAGTTTGTGTTCCCC-3'（沈Q ID N0:8)，
[0181] 5,-CCGMTTTATATGAGCTGCTA-3,（沈Q ID N0:9)。
[0182] 位點特異性PCR采用引物擴增WS3DNA特有序列結(jié)構(gòu)，即跨重復(fù)序列 邊界設(shè)計引物，引物序列為：5' -ACAGAGCCTCCATATCTCAG-3'（SEQ ID N0:10)， 5'-GGTAGCAGCACACTATTCCT-3'（SEQ ID N0:11)。PCR 擴增體系為 20ul，采用鼎國 Taq 酶系 統(tǒng)，包括DNA模板，2ul IOX緩沖液，2ul 2mM dNTP，0. 3ul Taq酶，最后用水補齊至20ul。 PCR反應(yīng)條件為：94°C 3min，然后進行35個循環(huán)的94°C 20s，55°C 30s，72°C 20s，最后72°C 延伸5min。
[0183] 9、農(nóng)藝性狀測量方法
[0184] 為了檢測qWS8對產(chǎn)量性狀的貢獻，本發(fā)明人檢測了包括莖粗，穗莖粗，分葉數(shù)，株 高，穗長，穗一級分支數(shù)，穗二級分支數(shù)，主穗小穗數(shù)，種子100粒重，每穗種子粒重，單株產(chǎn) 量。莖粗使用游標(biāo)卡尺對主莖第=節(jié)和第四節(jié)中間部分分別量取長軸直徑和短軸直徑，然 后取平均值。穗莖粗使用游標(biāo)卡尺直接測量穗軸下部緊連部分莖桿直徑。分葉數(shù)統(tǒng)計在植 株完全成熟后進行，同時在田間利用帶標(biāo)度竹尺直接測量株高，為地面到最高穗距離。穗長 為主穗從穗軸基部到最末端小穗的距離，不包括芒長。穗一級、二級分支數(shù)，種子粒重及小 穗數(shù)都從主穗上獲得。每穗種子粒重，100粒重及單株產(chǎn)量由電子天平稱取獲得。莖桿維 管束及壁厚統(tǒng)計方法為：采用徒手切片方法從第=節(jié)中間切取薄片，然后用甲苯胺藍染色， 體視顯微鏡下拍照獲得對應(yīng)圖片，根據(jù)圖片數(shù)對應(yīng)維管束數(shù)目，然后將圖片導(dǎo)入image J軟 件，并設(shè)置標(biāo)尺，量取莖壁厚度。
[0185] 10、石蠟切片及掃描電鏡
[0186] 取穗原基及幼嫩莖用FAA固定，其中石蠟切片樣品經(jīng)過梯度乙醇脫水，及梯度二 甲苯透明，及浸蠟過程，最終將樣品包埋到石蠟塊中，修塊后用萊卡切片機進行切片，切片 厚度為8-lOum，然后展片，貼片并烘干。再用用0. 025%的甲苯胺藍染色lOmin，清水漂洗干 凈后用二甲苯脫蠟，封片后即可到顯微鏡下觀察。掃描電鏡樣品經(jīng)過乙醇梯度脫水后，進行 二氧化碳臨界點干燥，然后噴金，即可到掃描電鏡下觀察。
[0187] 11、RNA提取、反轉(zhuǎn)錄W及定量PCR檢測
[0188] 植物樣品取樣后放到已加鋼珠且無RNA酶污染的管子中，然后立刻放到液氮中速 凍，再利用球磨儀將管子中的植物樣品粉碎，加入艾德萊公司的TRIpure RNA提取試劑解 育，其后步驟遵照該試劑說明書進行。mRNA反轉(zhuǎn)錄采用iScript CDNA合成試劑盒反應(yīng)生 成，具體步驟參照對應(yīng)說明書。小RNA反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司的SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Kit合成，具體步驟參照對應(yīng)說明書。然后設(shè)計特異引物分別擴增0SSPL14基因，小 RNA miR156 和 miR529p，其中 OsS化 14 基因引物序列為：5' -GACTAGCTGCATCTGTTGGTGAGC-3 ，（沈Q ID N0:12)，5'-TGCTGGCCATGCATTCCTTACG-3'（沈Q ID N0:13)。根據(jù) TaKaRa 試劑盒 要求，小RNA只需合成一條引物，即其序列本身，但需將U替換成T，而另一條為試劑盒內(nèi)公 用引物，故11111?156引物序列為5'-164〔4644646461646〔4(：-3'669 10側(cè)：14)，而11111?529? 引物序列為5'-AGAAGAGAGAGAGTACAGCC-3'(沈Q ID N0:15)。然后采用SYBR試劑標(biāo)記法進 行PCR擴增，所用試劑為TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq II TM,反應(yīng)體系及PCR條件 設(shè)置參照對應(yīng)說明書。采用化pendo計公司realtime PCR儀進行擴增。
[0189] 實施例1、新株型種質(zhì)發(fā)掘及主效基因定位
[0190] 根據(jù)國際水稻所對新株型的定義，本發(fā)明人在浙江地區(qū)種質(zhì)資源中發(fā)現(xiàn)了一種水 稻新型種質(zhì)，并將其命名為WS3(圖IA左）。與對照品種日本晴（Nip圖IA右）相比，WS3 莖粗約為0. 7-0. 8cm (圖1C-F)，分葉數(shù)平均為5個，一級分支高達30個（圖1C)，每穗小穗 數(shù)超過300個（圖1B)，具備典型的新株型特征。因此該種質(zhì)被用于后續(xù)基因挖掘的原始材 料，并與日本晴雜交構(gòu)建F2群體用于giL分析。
[0191] 通過使用均勻分布于水稻12條染色體上的145個多態(tài)性分子標(biāo)記，本發(fā)明人構(gòu)建 了 190株F2單株的飽和遺傳連鎖圖，結(jié)合對應(yīng)的四組莖粗?jǐn)?shù)據(jù)，進行g(shù)iL分析，最終在8號 染色體（CHR8)檢測到一個主效QTL (圖2)，該giL被命名為qWS8,置信度LOD約為18-23， 解釋了 15-24%的表型變異，單位點遺傳效應(yīng)為0.2-0.