4cm，表現(xiàn)為極高的遺傳效應。由于 莖粗屬于典型的數(shù)量性狀，進行基因定位需要高世代回交群體W排除背景噪音對表型的影 響。因此本發(fā)明人通過兩步法進行該位點的基因定位，首先將WS3與日本晴回交兩代，在 BC2F1 (即回交兩代后的雜交種Fl代）中鑒定對應位點化及整個遺傳背景的基因型，最終挑 選了兩株包含qWS8且遺傳背景噪音較少的單株用于產(chǎn)生BC2F2 (指回交兩代后再自交產(chǎn)生 的F2代）群體，該群體共包含445個單株（圖3)，通過qWS8置信區(qū)間內(nèi)的分子標記對運 些單株進行基因型鑒定，尋找交換個體，并對10個關(guān)鍵交換個體化1-L10)進行后代表型驗 證，最終將qWS8初步定位在540化的范圍內(nèi)。在初定位進行的同時，兩個BC2F1單株繼續(xù) 與日本晴回交，產(chǎn)生BC3F1 (指回交S代后的雜交種Fl代）單株，然后自交得到BC3F2 (指 回交=代后的再自交產(chǎn)生的F2代）群體，該群體共包含3404個單株，通過進一步用540化 范圍內(nèi)的標記篩選交換及后代驗證，最終本發(fā)明人將qWS8定位在兩個SNP之間，對應日本 晴基因組3059bp的區(qū)間（圖4)，根據(jù)水稻基因組注釋對該區(qū)間進行基因捜索發(fā)現(xiàn)沒有編碼 基因存在，由此提示該位置可能是一個調(diào)控元件，影響下游基因的表達。
[0192] 實施例2、qWS8特有結(jié)構(gòu)鑒定及其應用
[0193] 通過設(shè)計跨定位區(qū)間的引物，分別W日本晴（Nip)和WS3的基因組為擴增模板，本 發(fā)明人擴增了對應WS3的序列，然而沒有發(fā)現(xiàn)任何序列大小差異，但用基于酶切的DNA印 跡雜交技術(shù)檢測時，可W檢測到定位區(qū)間序列大小不同，WS3區(qū)間明顯大于Nip區(qū)間，而在 XbaI單酶切及其與其他酶組合雙酶切時，結(jié)合定位區(qū)間內(nèi)序列的探針，可W檢測到兩條帶， 而用更外側(cè)的探針則無法檢測到，運些結(jié)果說明WS3中包含了一段常規(guī)PCR無法檢測到的 重復序列，而且運些重復序列完全一致（圖5)。
[0194] 通過采用特殊高保真Taq酶，本發(fā)明人成功擴增出全長的WS3區(qū)域，并將該區(qū)段亞 克隆到載體中分段測序，最終得到完整WS3序列（SEQ ID NO: 1)，證實該區(qū)域存在S個日本 晴區(qū)域的順向重復，每個重復大小為313化P，且包含S個SNP。
[0195] qWS8包含一段特有的S片段順向重復結(jié)構(gòu)，運種序列結(jié)構(gòu)是鑒定qWS8最直接的 序列特征，因此可W設(shè)計引物擴增兩個順向重復元件的邊界區(qū)域，引物在沒有該結(jié)構(gòu)的品 種（如日本晴）中則呈現(xiàn)相反的結(jié)合特征，因此不能擴增；可W根據(jù)運一特點，尋找引物組 合用來鑒定qWS8位點（圖18)，本發(fā)明人找到了一對較優(yōu)的引物用于鑒定（引物序列為： SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11)，其可W特異性擴增qWS8獲得特定條帶，而對應日本晴無 法擴增出條帶，所W除了可W用DNA雜交的方法，采用PCR方法也可快速鑒定包含WS3位點 的品種，W浙江地區(qū)收集的19份新株型材料（J29-J47)為例，PCR結(jié)果顯示出與DNA雜交 一致的結(jié)果，且鑒定結(jié)果與對應表型變化一致（圖6)。
[0196] 另外，在特定的酶切組合下，DNA印跡雜交還可W用于鑒定雜合單株，便于精確判 斷基因型。例如，W EcoRI和XhoI酶切的DNA印跡雜交結(jié)果如圖7,其中包含兩條帶的單株 即為雜合單株。
[0197] 實施例3、qWS8位點影響多個重要農(nóng)藝性狀
[019引通過對精細定位的四個關(guān)鍵交換巧7、R8、R9、R10-B，其中RlO回交后形成分離株 系R10-B)進行細致的表型分析，發(fā)現(xiàn)qWS8不僅對莖粗有明顯促進效應，同時能夠極大地增 加一級分支數(shù)，同時適度降低分葉（圖8,不同字母表示差異顯著），運些都滿足國際水稻所 定義的新株型標準，因此本發(fā)明人認為qWS8是一個產(chǎn)生水稻新株型的重要位點。
[0199] 另外，該位點對株高沒有明顯的促進效應或者效應不大，暗示該位點對株高的促 進可能依賴特定的下游基因，但整體來說qWS8的株高負效應不大。為了進一步說明qWS8 對產(chǎn)量性狀及單株產(chǎn)量的貢獻，本發(fā)明人進一步發(fā)展了近等基因系（Nil-WS3Alleles， Nil-Nip Alleles, Nil-Hetero Alleles),并利用近等基因系中的雜合單株發(fā)展了對應的 群體進行一系列農(nóng)藝性狀鑒定（圖9)，結(jié)果顯示qWS8位點對第3、4節(jié)及穗莖節(jié)莖粗、穗一 級分支、穗二級分枝，每穗小穗數(shù)及單穗穗重都有顯著的促進效應，對穗長和株高也表現(xiàn)出 一定的促進效應，對分葉和百粒重表現(xiàn)為微弱的負效應，但單株整體表現(xiàn)為產(chǎn)量促進效應， 表明合理的株型能夠有效平衡產(chǎn)量元件，增加產(chǎn)量。qWS8雜合基因型表現(xiàn)為中親雜種優(yōu)勢 效應，即雜合型位點的性狀表現(xiàn)超過兩種純合位點的平均值，所W qWS8可W有效地應用到 雜交水稻品種的培育中。
[0200] 另外，通過石蠟切片對qWS8近等基因系的生長點分析發(fā)現(xiàn)，包含WS3位點植株的 生長點明顯大于包含NIP位點的植株的生長點，因此qWS8對新株型的塑造是從植株器官原 基形成開始的，然后伴隨著器官形成并最終成熟，差異進一步增加（圖10)。除了對莖粗有 直接影響外，qWS8還能夠增加莖桿的大、小維管束數(shù)目，并增加莖壁厚度（圖10下右），運 些特征都表明qWS8是一個多效性的Q化，能夠綜合促進水稻植株形成優(yōu)良株型，最終實現(xiàn) 增產(chǎn)目標。
[020。 實施例4、qWS8通過上調(diào)下游基因 OsS化14影響株型
[020引 由于qWS8沒有編碼任何基因，而一個植物特有的轉(zhuǎn)錄因子OsS化14位于qWS8下 游約4化處，本發(fā)明人對qWS8近等基因系花序原基進行不同時期的連續(xù)取樣，并W苗期組 織為對照（圖11)，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成CDNA用于表達量差異分析，實時定量PCR結(jié)果顯 示：WS3的qWS8位點能夠明顯上調(diào)其下游0sSPL14基因，由于OsSPLH同時受MicroRNA 156 和529p調(diào)控，本發(fā)明人同時檢測了對應組織中miR156和miR529p的表達量，發(fā)現(xiàn)miR156 在原基組織中表達量很低，而在苗期的表達量很高，對應0SSPL14在苗期的表達量則很低， miR529除了在苗期表達量高外，在原基發(fā)育末期表達量升高，從而導致原基中的0SSPL14 在后期呈現(xiàn)表達下降趨勢（圖12)，運些結(jié)果表明miR156和miR529p對0SSPL14基因的調(diào) 控主要局限在植株幼苗期和原基發(fā)育近乎完成的時期，而在原基旺盛分裂過程則幾乎不發(fā) 揮作用，而qWS8是導致運一階段0sSPL14表達上調(diào)的直接原因。
[020引實施例5、基于qWS8的品種鑒定
[0204] qWS8的應用價值主要體現(xiàn)在快速改良沒有該位點的品種，特別是那些庫容量不夠 或易倒伏的品種。本發(fā)明人對qWS8在自然品種中的分布進行了細致分析，群體包括約200 份新株型種質(zhì)資源，100多份地方品種種質(zhì)資源W及96份現(xiàn)代品種資源，發(fā)現(xiàn)qWS8主要富 集在與WS3類似起源的新株型種質(zhì)資源中（表3)，對應品種也表現(xiàn)為粗桿大穗的特征（圖 19下），而在地方品種和現(xiàn)代栽培品種中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)，說明qWS8位點可能是一種最近起 源的突變類型或者引進類型，而且還沒有被廣泛地應用到現(xiàn)代品種培育過程中。在運些富 集qWS8位點的新株型品種中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在WS3和NIP間存在差異的屯個SNP中有S個 可W用于特異判斷qWS8位點，原因如下：在運些新株型種質(zhì)資源中，屯個SNP形成S種組 合類型（分別W WS3, NIP和ZS97為代表），而在所有包含qWS8位點的植株中，運S個SNP 是特有的，然而其中兩個（圖19上圖中1、3號框標注，對應水稻基因組IRGSP Releases Build 4. 0化巧:25367350和25374393)仍然能夠在不包含qWS8位點的地方品種中（包括 公共數(shù)據(jù)資源）檢測到，但頻率很低（表1)，而剩下一個SNP (圖19上圖中2號框標注，對 應沈Q ID NO: 1中第409、3549、6689位）則是與qWS8絕對連鎖的SNP，因此運個SNP成為 鑒定qWS8的另外一個有效方法，而由于剩余兩個SNP在現(xiàn)代品種中已經(jīng)被選擇掉，所W在 一定程度上也可用來輔助鑒定qWS8位點。本發(fā)明人已經(jīng)成功將特有SNP(30677)和兩側(cè)的 兩個SNP (ProSNP3和SNP3)發(fā)展為基于PCR擴增和酶切的分子標記（表1)，用于鑒定現(xiàn)有 品種中是否包含qWS8位點。所W到目前為止，已經(jīng)發(fā)展了S種不同的方法（如實施例2記 載）用于鑒定qWS8位點，分別是DNA印跡雜交，PCR擴增特殊結(jié)構(gòu)W及完全連鎖分子標記 鑒定，在品種鑒定時可W根據(jù)實際條件選擇合適的方法進行操作。
[0205] 表1中所有引物擴增產(chǎn)物的長度不超過4(K)bp，PCR反應條件同前述。PCR產(chǎn)物需 要用表1列出的對應酶進行酶切，體系為IOul PCR產(chǎn)物，2ul 10 Xbuffer, 0. 3ul酶，用水補 齊至20ul。使用的酶為化ermo Scientific的普通酶或快速酶，具體參見其說明書。酶切 完成后進行3 %濃度的瓊脂糖凝膠電泳。
[0206] 表3、qWS8位點SNP在地方品種及現(xiàn)在品種中的分布
[0207]
[0208] 注：N.化表示沒有檢測，而小數(shù)值表示W(wǎng)S3的SNP在不同群體中的比例。
[0209] 實施例6、qWS8在水稻育種中的應用潛力和經(jīng)濟價值
[0210] 盡管qWS8能夠形成良好的株型，但其在育種中的價值需要實踐檢測，甫優(yōu)12是浙 江地區(qū)培育的超級雜交稻品種，該品種在2012的百畝區(qū)試中平均畝產(chǎn)達963. 65kg，而最高 畝產(chǎn)則高達1014. 3kg，打破全國產(chǎn)量紀錄。本發(fā)明人對甫優(yōu)12商業(yè)化的雜交種植株進行 DNA印跡雜交鑒定發(fā)現(xiàn)該品種包含qWS8位點，本發(fā)明人對該雜交種收獲的F2群體進行遺傳 位點貢獻率分析發(fā)現(xiàn)，qWS8位點約貢獻了 50%的莖粗和穗一級分支的表型變異（圖13)， 說明甫優(yōu)12的產(chǎn)量基礎(chǔ)很大一部分是由qWS8貢獻的。
[0211] 除了在梗稻品種日本晴背景下展現(xiàn)出良好的株型效應，本發(fā)明人同時將qWS8導 入到早釉品種ZS97中，該品種為中國雜交稻推廣面積最廣的釉優(yōu)63的親本之一。結(jié)果顯 示，qWS8在ZS97遺傳背景中依然展現(xiàn)良好的株型特點和增產(chǎn)潛力，能夠顯著增加莖粗和穗 一級分支數(shù)（圖14)，因此qWS8可W有效地改良現(xiàn)有的釉稻和梗稻品種，同時也可應用到雜 交水稻品種的培育。
[0212] 實施例7、qWS8與其它有益性狀相關(guān)基因的聚合應用
[0213] qWS8可W與其它株型位點有效聚合，除了 qWS8,本發(fā)明人還在WS3背景中定位到 一個增加穗長的Q化，該giL被命名為qPL6。
[0214] 由于qPL6也表現(xiàn)出增產(chǎn)潛力和抗倒伏效應，本發(fā)明人將其定位到約25肺的物理 區(qū)間內(nèi)（圖16)，該區(qū)間內(nèi)有=個候選基因，對運=個候選基因進行測序發(fā)現(xiàn)，只有一個候 選基因表現(xiàn)在蛋白編碼區(qū)存在序列差異，因此認為運個基因是qPL6的候選基因（序列及其 promoter區(qū)見SEQ ID NO: 16)。根據(jù)其編碼區(qū)的兩個SNP，設(shè)計了分子標記，同時本發(fā)明人 也利用鄰近的另一個基因的SNP設(shè)計了S個分子標記，共計5個分子標記（表1)，利用運個 五個分子標記對96個現(xiàn)代品種進行分析，發(fā)現(xiàn)標記組合在釉稻和梗稻中表現(xiàn)出明顯分化， 而且五個標記完全連鎖，因此該標記組合適合選擇WS3與梗稻雜交的組合群體，進而導入 qPL6而改良梗稻品種，或與qWS8聚合進一步提高產(chǎn)量潛力。
[0215] qPL6除了能夠增加穗長外，還能夠顯著促進其他產(chǎn)量元件，包括穗一級分支，穗二 級分支，每穗粒數(shù)，并能夠增加莖粗，具備抗倒伏能力，而對株高，分葉數(shù)和結(jié)實率則無顯著 負效應（圖15)。
[0216] 通過連續(xù)回交和分子標記篩選，本發(fā)明人成功將兩個位點聚合到一起，相比沒有 兩個位點的植株或只有一個位點的植株，兩者聚合表現(xiàn)為最優(yōu)的株型和產(chǎn)量效應，聚合單 株具有更粗的莖桿和更多的穗分支，并產(chǎn)生更多的小穗數(shù)，表現(xiàn)為極大的增產(chǎn)潛力（圖 17)，運將成為一種培育高產(chǎn)水稻品種快速有效的策略，為今后育種實踐提供技術(shù)支持。
[0217] 實施例8、進一步開發(fā)用于絕大多數(shù)品種或群體鑒定的SNP
[021引根據(jù)重復元件及其側(cè)翼序列上屯個SNP信息（圖19)，；本發(fā)明人進一步捜索了近 期測序的3000份水稻品種的SNP數(shù)據(jù)庫化ttp://www. Oirzas噸.org/iric-portal/)，排除 無效數(shù)據(jù)后，獲得了 2464個品種對應屯個SNP的類型，共計形成10類SNP單體型（圖23)， WS3 (qWS8位點）對應的單體型為HaplO,且只有5個品種屬于該單體型，證明qWS8位點在 自然品種中非常稀有。除了已有的S個緊密連鎖的SNP標記（圖23a中*標注，對應表1 的ProSNP3,30677和SNP3標記），本發(fā)明人又發(fā)展了S個SNP標記（圖23a中標號1、4、5 的箭頭），運樣6個標記可W實現(xiàn)對所有品種的單體型鑒定，用于精確判斷qWS8位點。另 夕F，運些不同的單體型還存在一些亞種分化特征，如Hapl主要集中于釉稻中，而Hap2主要 集中于梗稻中，進一步提高運些分子標記的使用及分析價值。利用運6對SNP分子標記，可 W清楚的分辨=個HaplO品種化1-L3)的單體型（圖23b)，與數(shù)據(jù)庫結(jié)果完全一致。盡管 如此，本發(fā)明人對S個HaplO品種進行了 DNA印記雜交檢測和重復序列特異PCR檢測，發(fā)現(xiàn) 雖然L3品種具有與WS3完全一致的SNP單體型，但其并不包含qWS8位點，對應植株也不具 備良好的株型特征（圖24)。因此，