一種用于檢測(cè)胎兒染色體非整倍體的試劑盒、引物和探針序列及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及染色體檢測(cè)，特別設(shè)及母血中胎兒游離核酸的檢測(cè)，尤其是利用數(shù)字 PCR技術(shù)檢測(cè)胎兒非整倍體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 出生缺陷是當(dāng)前優(yōu)生優(yōu)育急需要解決的問題，染色體異常是導(dǎo)致出生缺陷的重要 原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，新生兒染色體異常的發(fā)生率約為0.5。在眾多染色體異常疾病中，染色體非整 倍體導(dǎo)致的殘疾及生活障礙尤為明顯。其中又W21-=體(唐氏綜合征）、18-=體(愛德華氏 綜合征)和13-=體(帕陶氏綜合征)=種常染色體非整倍體最為常見，在新生兒中的發(fā)病率 分別為1/800、1/6000和1/10000。雖然染色體非整倍疾病會(huì)發(fā)生在所有孕婦年齡，但是隨著 孕婦年齡的增高，染色體非整倍疾病的發(fā)生率也會(huì)明顯上升。目前，尚無有效的治療方法來 治愈胎兒染色體疾病，而每一個(gè)=體綜合征患兒的出生都會(huì)給家庭和社會(huì)造成巨大的精神 和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，進(jìn)行產(chǎn)前篩查與診斷來避免患兒的出生是目前控制染色體非整倍體疾病的最 有效措施。
[0003] 目前檢測(cè)染色體非整倍體疾病的方法有多種，主要分為兩大類，一類是有創(chuàng)診斷， 主要有絨毛膜穿刺、羊膜腔穿刺及經(jīng)廝靜脈穿刺技術(shù)，該類方法通過胎兒細(xì)胞確定染色體 核型，是診斷胎兒染色體非整倍體疾病的金標(biāo)準(zhǔn)，但運(yùn)些技術(shù)增加了不必要的侵入，對(duì)胎兒 和孕婦有一定程度的傷害，伴有約1%的流產(chǎn)、宮內(nèi)感染、早產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)。由于上述風(fēng)險(xiǎn)，所W 有創(chuàng)的方法不能用于大規(guī)模篩查，只適合做高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的確認(rèn);另一類是無創(chuàng)篩查，根據(jù)篩 查的標(biāo)志物的不同，無創(chuàng)篩查又分傳統(tǒng)的血清篩查和新一代高通量的核算測(cè)序篩查。血清 篩查是檢測(cè)母體血清中的蛋白標(biāo)記物為檢測(cè)對(duì)象，由于蛋白表達(dá)受調(diào)控的復(fù)雜性，檢測(cè)的 準(zhǔn)確性很差，所W血清篩查有很高的假陽性率和漏檢率，檢測(cè)的實(shí)際意義不大。
[0004] 1997年Lo等化〇 YM'Corbetta N，化amberlain PF，et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum丄ancet，1997,350(9076):485-487)發(fā)現(xiàn)在孕婦血漿 中存在游離的胎兒DNA，并且胎兒游離DNA含量占母體血漿總DNA的3~6%，且含量隨著孕周 的增長(zhǎng)而增加，到孕晚期還有一個(gè)急劇增加的過程，上述研究為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)的誕生 提供了前提。在此理論基礎(chǔ)上，illumina公司和life technologies公司的高通量測(cè)序平臺(tái) 已應(yīng)用于無創(chuàng)DNA產(chǎn)前診斷。雖然，基于高通量測(cè)序的無創(chuàng)DNA產(chǎn)前診斷技術(shù)，具有準(zhǔn)確度 高、通量高等優(yōu)點(diǎn);但高通量的操作平臺(tái)要求較高，目前只有第=方的大型測(cè)序公司能完成 運(yùn)項(xiàng)檢測(cè)。高通量測(cè)序進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的步驟包括:血漿DNA提取，文庫(kù)構(gòu)建，質(zhì)檢定量混 庫(kù)，在二代測(cè)序儀上測(cè)序，信息分析處理。想獨(dú)立完成高通量測(cè)序進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)需要高 額的設(shè)備投資和各操作步驟的專業(yè)人才。
[0005] 數(shù)字PCR技術(shù)是通過將微量樣品作大倍數(shù)稀釋和分液(partitioning)，直至每個(gè) 樣品中所含有的待測(cè)分子數(shù)不會(huì)超過1個(gè)拷貝，再將所有樣品在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 并對(duì)發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)的樣品逐個(gè)進(jìn)行計(jì)數(shù)的一種技術(shù)。數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對(duì)定量 技術(shù)，比實(shí)時(shí)PCR更為精確，可W對(duì)胎兒游離DNA進(jìn)行精確定量分析，而且不依賴胎兒性別及 遺傳多態(tài)性，甚至可允許有母體DNA的污染和嵌合體的存在。數(shù)字PCR具有卓越的靈敏度、準(zhǔn) 確度及可重復(fù)性，在稀有突變檢測(cè)、拷貝數(shù)變異、基因相對(duì)表達(dá)等方面的檢測(cè)具有明顯的優(yōu) 越性。Lo等化〇 YM，Lun FM，Qian KC，et al.Digital PCR for the mole州Iar detection of fetal chromosomal aneuploidy.Proc 化tl Acad Sci USA，2007,104(32):13116-13121)利用數(shù)字PCR，通過檢測(cè)PLAC4 mRNA SNP，W及比較21號(hào)染色體與I號(hào)染色體上相應(yīng) 位點(diǎn)的相對(duì)染色體劑量的方式診斷胎兒非整倍體。雖然上述方法可W診斷嵌合體，但其需 要胎兒非整倍體DNA含量需達(dá)到胎兒DNA總含量的25% W上，極大地限制該方法的應(yīng)用。
[0006] 在上述基礎(chǔ)上，數(shù)字PCR技術(shù)及其在胎兒染色體檢測(cè)中的應(yīng)用逐步深入?，F(xiàn)在通常 使用的數(shù)字PCR儀器主要是Thermo Fisher Scientific公司的QuantStudio? 3D、 RainDance公司的Rain化op digital PCR System和Bio-RAD公司的QX200。^個(gè)廠家的數(shù)字 PCR儀的共同特點(diǎn)是都是數(shù)量可觀的分散小液滴，區(qū)別在于化ermo FiSher ScientifiC公 司利用的是忍片微孔，另兩家公司是油包水的小液滴。
[0007] 目前，基于數(shù)字PCR技術(shù)開展的胎兒基因組或核巧酸檢測(cè)已有多種，例如：專利 W02011057094A中所披露的由母本生物樣品進(jìn)行胎兒基因組分析，其通過分析來自母本樣 品的胎兒DNA片段W鑒定某些基因座位處的等位基因，綜合分析運(yùn)些基因座位處各自等位 基因的DNA片段的量，W確定運(yùn)些基因座的單倍型的相對(duì)量，并確定從親本基因組遺傳了哪 種單倍型，從而在產(chǎn)前構(gòu)建胎兒的全基因組或所選基因區(qū)域的基因圖譜，基于上述圖譜確 定胎兒患遺傳病或其他疾病或遺傳性狀的風(fēng)險(xiǎn)。然而上述方法的實(shí)施主要依賴與數(shù)據(jù)分析 和處理系統(tǒng)，需要強(qiáng)大的后臺(tái)分析儀器支持，也需要專業(yè)的數(shù)據(jù)分析人員，不利于臨床應(yīng)用 的推廣。美國(guó)專利US2011151442A1則披露了胎兒非整倍體的分子檢測(cè)方法，該方法運(yùn)用數(shù) 字PCR技術(shù)對(duì)來自胎兒組織樣本的單個(gè)目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，用于檢測(cè)染色體非整倍 體或變異。然而，上述方法基于的樣品是胎兒組織，雖然克服了羊水穿刺檢測(cè)中需要細(xì)胞培 養(yǎng)的問題，但是胎兒組織的獲取必然會(huì)帶來潛在的感染或其他不利影響，并且該專利在PCR 擴(kuò)增中針對(duì)每個(gè)目標(biāo)序列使用單一的引物序列，勢(shì)必會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度。國(guó)內(nèi) 專利主要是化201510274271.0公開的多重?cái)?shù)字PCR技術(shù)在染色體非整倍體篩查中的應(yīng)用， 其W胎兒游離DNA的妊娠對(duì)象外周血為檢測(cè)樣品，從外周血樣本分離去除細(xì)胞，并從去除細(xì) 胞的所述樣品中富集DNA，得到DNA樣本，將上述樣品分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行多重?cái)?shù)字PCR 擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果確定染色體數(shù)目。該專利技術(shù)避免了上述專利中樣本的獲取W及數(shù)據(jù) 分析方面的弊端，但是由于在其擴(kuò)增方法中引物對(duì)數(shù)使用較少，因而擴(kuò)增中對(duì)樣本DNA含量 的要求較高，其僅能準(zhǔn)確檢測(cè)小于5 %和10 %的21S體胎兒DNA。
[0008] 因而，期望能夠提供一種可W非侵入性、高靈敏度、高準(zhǔn)確性地鑒定胎兒染色體非 整倍體的試劑盒和方法，W便于臨床的推廣引用。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0009] 本發(fā)明的目的就是為了克服血清篩查技術(shù)存在檢測(cè)不準(zhǔn)確的問題和高通量篩查 技術(shù)操作要求高，投入成本巨大的缺點(diǎn)，提供一種操作簡(jiǎn)單、低成本、快速、高準(zhǔn)確度的試劑 盒、引物及其使用方法，用于數(shù)字PCR平臺(tái)檢測(cè)胎兒染色體數(shù)目變異。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的檢測(cè)染色體數(shù)目的目的，本發(fā)明一方面設(shè)計(jì)了提供一種用于檢 測(cè)胎兒染色體數(shù)目倍性的試劑盒和引物，根據(jù)第13、18和21號(hào)染色體的基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增 引物和taqman探針。在血漿中母體和胎兒游離的DNA不是完整的染色體和大片段存在，所W 可W在一條染色體上設(shè)計(jì)多個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)，運(yùn)樣可W更準(zhǔn)確的檢測(cè)13、18和21號(hào)染色體的數(shù) 目。在本發(fā)明中在13、18和21號(hào)染色體上分別設(shè)計(jì)和篩選出10個(gè)位點(diǎn)合格的擴(kuò)增引物和探 針。在每條染色體上不完全均勻分布設(shè)計(jì)10個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)，運(yùn)樣設(shè)計(jì)有兩個(gè)好處:第一，提高 檢測(cè)的準(zhǔn)確性，不會(huì)由于一個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的隨機(jī)誤差影響檢測(cè)結(jié)果;第二，如果染色體是部分 =體，也可W做出精確判斷。
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