度在50nM~150nM范圍均有目的條帶，在探針濃度為50nM 時(shí)最優(yōu)。
[0150] 實(shí)施例7引物和探針組合擴(kuò)增最佳反應(yīng)體系的確定
[01引]WSEQ ID No = I-SEQ ID No:60的核巧酸序列為引物與探針，W實(shí)施例1制備的陰 性對(duì)照為模板進(jìn)行巧光定量PCR驗(yàn)證（20iiL體系中各成分的終濃度為1 XPCR Buffer、 0.25mM dNTP、IU/反應(yīng)DNA聚合酶、50nM引物、50nM探針、25ng模板DNA，余量為水）。巧光定量 PCR反應(yīng)條件:60°C退火并延伸60秒，一個(gè)循環(huán);95°C預(yù)變性10分鐘，一個(gè)循環(huán);40個(gè)擴(kuò)增循 環(huán)，95°C變性15秒，60°C退火并延伸60秒，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，引物和探針組合擴(kuò)增 效率最佳。
[0152] 實(shí)施例8引物和探針組合擴(kuò)增最佳反應(yīng)體系的確定
[0153] W沈Q ID No = I-SEQ ID No:30和沈Q ID No:61-沈Q ID No:90的核巧酸序列為引 物與探針，W實(shí)施例1制備的陰性對(duì)照為模板進(jìn)行巧光定量PC閲金證(2化L體系中各成分的 終濃度為1 XPCR Buffer、0.25mM dNTP、lU/反應(yīng)DNA聚合酶、50nM引物、50nM探針、25ng模板 DNA，余量為水）。巧光定量PCR反應(yīng)條件:60°C退火并延伸60秒，一個(gè)循環(huán);95°C預(yù)變性10分 鐘，一個(gè)循環(huán);40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，95°C變性15秒，60°C退火并延伸60秒，結(jié)果如圖6所示。由圖6 可知，引物和探針組合擴(kuò)增效率最佳。
[0154] 實(shí)施例9采用本申請(qǐng)?jiān)噭┖羞M(jìn)行染色體數(shù)目分析的方法
[0155] 通過(guò)數(shù)字PCR檢測(cè)染色體數(shù)目，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法包括
[0156] (1)根據(jù)人類第13號(hào)、18號(hào)和21號(hào)染色體的基因序列，分別設(shè)計(jì)10對(duì)特異性引物和 10條特異性化qman探針。
[0157] (2)孕婦血漿DNA提取
[0158] (3)配制數(shù)字PCR擴(kuò)增基因序列的反應(yīng)體系。
[0159] (4)通過(guò)數(shù)字PCR檢測(cè)染色體數(shù)目計(jì)算胎兒13、18和21號(hào)染色體數(shù)目。利用數(shù)字PCR 檢測(cè)忍片每個(gè)反應(yīng)單元的FAM和VIC巧光，分別計(jì)算=條染色體的拷貝數(shù)。
[0160] 數(shù)字PCR的反應(yīng)體系為：
[0161]
[0162]所述數(shù)字PCR的反應(yīng)條件是96 °C預(yù)變性10分鐘；39個(gè)循環(huán)60°C延伸2分鐘，98°C變 性30秒；60 °C延伸2分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在數(shù)字PCR平臺(tái)檢測(cè)FAM和VIC巧光信號(hào)，并通過(guò) 如antSl:udio? 3D AnalysisSuite? Software計(jì)算每條染色體的拷貝數(shù)。第13、18、21號(hào)染 色體的拷貝數(shù)分別記為41、81、(：1，并分別計(jì)算比值(：1/41和(：1/81，分別記為1?1和尺2。
[0163] 當(dāng)Rl和R2均等于或約等于1時(shí)，則表明胎兒染色體正常；
[0164] 當(dāng)Rl和R2均大于或約等于1.025時(shí)，則表明胎兒為21S體；
[0165] 當(dāng)Rl等于或約等于1，R2小于或約等于0.975時(shí)，則表明胎兒為18S體；
[0166] 當(dāng)R2等于或約等于1，R1小于或約等于0.975時(shí)，則表明胎兒為13S體。
[0167] 所有在本說(shuō)明書(shū)中引用的參考文獻(xiàn)和專利申請(qǐng)?jiān)诖颂幰胱鳛閰⒖?，就如同每?出版物或?qū)＠暾?qǐng)被明確和單獨(dú)地引入作為參考一樣。盡管為了明確理解的目的，已經(jīng)通 過(guò)說(shuō)明和實(shí)施例的方式，詳細(xì)描述了上述發(fā)明，但在本發(fā)明的教導(dǎo)下，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員而言，顯而易見(jiàn)的是，可W對(duì)本發(fā)明進(jìn)行某些改變和修改而不背離所附權(quán)利要求的精神 或范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)胎兒染色體非整倍體的試劑盒，包括:根據(jù)人類第13號(hào)、第18號(hào)和第21 號(hào)染色體基因序列，設(shè)計(jì)的多對(duì)特異性引物和多條特異性Taqman探針；以及用于進(jìn)行數(shù)字 PCR的反應(yīng)體系。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述多對(duì)特異性引物和多條特異性Taqman探針的 核苷酸序列為SEQ ID NO: 1-90。3. 如權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述多對(duì)特異性引物和多條特異性 Taqman探針序列分為兩組:第一組包括SEQ ID NO: 1-60的核苷酸序列，第二組包括SEQ ID NO: 1-30、61-90的核苷酸序列。4. 用于檢測(cè)胎兒染色體非整倍體的特異性引物和Taqman探針，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1-90〇5. 如權(quán)利要求4所述的用于檢測(cè)胎兒染色體非整倍體的特異性引物和Taqman探針，其 中所述特異性引物和Taqman探針?lè)譃閮山M，第一組包括SEQ ID N0:l-60的核苷酸序列，第 二組包括SEQ ID NO: 1-30、61-90的核苷酸序列。6. -種體外非侵入性檢測(cè)胎兒染色體非整倍體的方法，包括如下步驟： (1) 根據(jù)人類第13號(hào)、第18號(hào)和第21號(hào)染色體基因序列，設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物和多條特 異性Taqman探針； (2) 采集孕12-23周孕婦外周血用于血漿DNA提?。? (3) 配制數(shù)字PCR擴(kuò)增基因序列的反應(yīng)體系； (4) 通過(guò)數(shù)字PCR檢測(cè)染色體數(shù)目計(jì)算胎兒13、18和21號(hào)染色體數(shù)目，利用數(shù)字PCR檢測(cè) 芯片每個(gè)反應(yīng)單元的FAM和VIC熒光，分別計(jì)算13、18和21染色體的拷貝數(shù)。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述多對(duì)特異性引物和多條特異性Taqman探針的序 列為：SEQ ID NO: 1-90。8. 如權(quán)利要求6-7任一項(xiàng)所述的方法，其中所述孕婦外周血血漿DNA的提取步驟為:a、 抽取孕婦外周血l〇ml于EDTA抗凝管中，上下顛倒混勻8次，室溫保存;b、分離外周血血漿，以 1600g常溫下離心10min，離心后將上清(血漿)分裝到1.5ml離心管中，再次以16000g常溫下 離心10min去除殘余細(xì)胞，收集離心所獲上清并分裝到1.5ml離心管中，每管分裝血漿的體 積為450yL; c、提取收集所獲得的血漿中的DNA并進(jìn)行定量。9. 如權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述的方法，其中所述數(shù)字PCR擴(kuò)增基因序列的反應(yīng)體系的配 制包括將引物和探針序列SEQ ID NO: 1-90分為第一組和第二組的步驟。10. 如權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一組包括SEQ ID NO: 1-60的核苷酸 序列，所述第二組包括SEQ ID N0:l-30、61-90的核苷酸序列，并且第一組用于檢測(cè)21和18 號(hào)染色體，第二組用于檢測(cè)21和13號(hào)染色體。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)胎兒染色體非整倍體的試劑盒、引物和探針序列及檢測(cè)方法。其中試劑盒包括：根據(jù)人類第13號(hào)、第18號(hào)和第21號(hào)染色體基因序列，設(shè)計(jì)的多對(duì)特異性引物和多條特異性Taqman探針；以及用于進(jìn)行數(shù)字PCR的反應(yīng)體系；其中，該多對(duì)特異性引物和多條特異性Taqman探針的核苷酸序列為SEQ ID NO:1-90；其中檢測(cè)方法包括(1)根據(jù)人類第13號(hào)、第18號(hào)和第21號(hào)染色體基因序列，設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物和多條特異性Taqman探針；(2)采集孕12-23周孕婦外周血用于血漿DNA提??；(3)配制數(shù)字PCR擴(kuò)增基因序列的反應(yīng)體系；(4)通過(guò)數(shù)字PCR檢測(cè)染色體數(shù)目計(jì)算胎兒13、18和21號(hào)染色體數(shù)目，利用數(shù)字PCR檢測(cè)芯片每個(gè)反應(yīng)單元的FAM和VIC熒光，分別計(jì)算13、18和21染色體的拷貝數(shù)。采用上述試劑盒和方法可以高效快速準(zhǔn)確無(wú)創(chuàng)的完成對(duì)胎兒13、18和21號(hào)染色體數(shù)目的檢測(cè)，有利于臨床應(yīng)用和推廣。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105695567
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510857412
【發(fā)明人】劉濤
【申請(qǐng)人】北京昱晟達(dá)醫(yī)療科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年6月22日
【申請(qǐng)日】2015年11月30日