細胞或組織的玻璃化冷凍保存用工具的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明設及在冷凍保存生物的細胞或組織等時使用的玻璃化冷凍保存用工具。
【背景技術】
[0002] 在各種各樣的產(chǎn)業(yè)領域中需要生物的細胞或組織的優(yōu)質保存技術。例如，在牛的 胚胎移植技術中使用的胚胎是配合受體牛(受胚牛）的發(fā)情周期進行移植的，為了配合發(fā)情 周期進行胚胎的移植，將胚胎冷凍保存，配合發(fā)情周期，將胚胎融解進行移植。而且，在人的 不孕治療中，在從母體采集卵子或卵巢后，為了配合適合移植的時機而冷凍保存，在移植時 融解使用。
[0003] -般來說，從活體內采集的細胞或組織，例如即使是在培養(yǎng)液中也會逐漸失去活 性，因此，在活體外的細胞或組織的長期培養(yǎng)是不可取的。為此，不損害生物活性的長期保 存的技術是重要的。通過優(yōu)異的保存技術，可W更加正確地分析所采集的細胞或組織。而 且，通過優(yōu)異的保存技術，可W用于在保持更高的生物活性的狀態(tài)下移植，有望提高移植后 的成活率。此外，也可W將在活體外培養(yǎng)的培養(yǎng)皮膚和在活體外構筑的類似于所謂細胞片 的移植用的人工組織按順序生產(chǎn)保存，在必要時使用，不僅在醫(yī)療方面、在產(chǎn)業(yè)方面也是廣 泛需求的技術。
[0004] 作為細胞或組織的保存方法，例如已知有緩慢冷凍法。在此方法中，首先，在使憐 酸緩沖生理鹽水等的生理溶液中含有冷凍保護劑而得到的保存液中浸潰細胞或組織。作為 該冷凍保護劑，使用甘油、乙二醇等化合物。將細胞或組織在該保存液中浸潰后，通過W比 較慢的冷卻速度(例如0.3~0.5°C/分鐘的速度)冷卻至-30~-35°C，使細胞內外或組織內 外的溶液充分冷卻，粘度變高。在運樣的狀態(tài)下，如果將該保存液中的細胞或組織進一步冷 卻至液氮的溫度(-196°C)的話，細胞內或組織內W及其外面的周圍的少許溶液均發(fā)生變成 非晶固體的玻璃化。可W認為，因為通過玻璃化，細胞內外或組織內外固化，實質上分子的 運動消失，所W通過將玻璃化的細胞或組織在液氮中保存，可W半永久地保存。
[0005] 然而，在上述緩慢冷凍法中，因為需要W比較慢的冷卻速度冷卻，所W為了進行冷 凍保存的操作需要時間。而且，還存在需要用于進行溫度控制的裝置或工具的問題。此外， 在上述緩慢冷凍法中，因為在細胞外或組織外的保存液中形成冰晶，所W細胞或組織可能 遭受該冰晶造成的物理性損害。
[0006] 作為解決在上述緩慢冷凍法中的問題點的方法，有人提議玻璃化保存法。玻璃化 保存法是利用了通過大量含有甘油、乙二醇、DMSO(二甲基亞諷)等冷凍保護劑降低水溶液 的凝固點，使得即使在冰點下也難W形成冰晶的原理的方法。將此水溶液在液氮中急速冷 卻，可W不形成冰晶直接固體化。將運樣的固體化稱為玻璃化冷凍。而且，將大量含有冷凍 保護劑的水溶液稱為玻璃化液。
[0007] 作為上述玻璃化保存法的具體操作為:在玻璃化液中浸潰細胞或組織，之后，冷卻 至液氮的溫度(-196°C)。因為是如此簡便且迅速的步驟，所W在用于冷凍保存的操作中不 需要時間，此外，不需要用于溫度控制的裝置或工具。
[0008] 使用玻璃化保存法，細胞內外不產(chǎn)生任何冰晶，因此可W避免對于冷凍時和融解 時對細胞的物理性傷害(凍害），然而，玻璃化液中含有的高濃度的冷凍保護劑具有化學性 毒性，在細胞或組織的冷凍保存時，玻璃化液不超過必要量W上為好。同時，細胞或組織在 玻璃化液中暴露的時間、也就是到達冷凍的時間W短時間為好。進一步地，解凍后需要立即 將玻璃化液稀釋。
[0009] 關于使用運些玻璃化保存法的細胞或組織的冷凍保存，有人給出了通過各種各樣 的方法、使用各種各樣的種類的細胞或組織的例子。例如，專利文獻1顯示，對于動物或人的 生殖細胞或體細胞的玻璃化保存法的應用，在冷凍保存、融解后的生存率的方面是極其有 用的。
[0010] 玻璃化保存法主要是用于人的生殖細胞而發(fā)展起來的技術，然而，最近也廣泛地 探討在iPS細胞和ES細胞上的應用。而且，非專利文獻1顯示，在果蛹胚胎的保存中玻璃化保 存法是有效的。進一步地，專利文獻2或非專利文獻2顯示，在植物培養(yǎng)細胞和組織的保存 中，玻璃化保存法是有效的。運樣，已經(jīng)知道玻璃化保存法在大范圍的各種各樣的種的細胞 和組織中是有用的。
[0011] 作為用于更加有效地進行玻璃化保存法的工具和操作方法，專利文獻3等嘗試在 吸管中充滿的玻璃化液中，將卵子或胚胎進行玻璃化冷凍保存，解凍時盡快與稀釋液接觸 提高再生率。
[0012] 專利文獻4提議，將卵子或胚胎與玻璃化液一起放在玻璃化保存液除去材料上，通 過從下部吸引除去在卵子或胚胎的周圍附著的多余的玻璃化液，W高的生存率冷凍保存的 方法。另外，也有記載作為玻璃化保存液除去材料有:金屬絲網(wǎng)；由紙等天然物質或合成樹 脂制成的膜狀物且具有貫通孔的材料。
[0013] 專利文獻5提議，通過將卵子或胚胎的周圍附著的多余的玻璃化液使用濾紙等吸 收體吸收，W高的生存率進行冷凍保存的方法。
[0014] 專利文獻6、專利文獻7提議，在人的不孕治療領域使用的所謂的被稱作Cryotop法 的方法中，使用作為卵子附著固定用帶的長方形的柔性且無色透明的膜，在該膜上將極少 量玻璃化液和卵子或胚胎一起在顯微鏡下使之附著、冷凍保存的方法。
[0015] 現(xiàn)有技術文獻
[0016] 專利文獻
[0017] 專利文獻1:日本特許第3044323號公報
[0018] 專利文獻2:日本特開2008-5846號公報
[0019] 專利文獻3:日本特開平10-248860號公報
[0020] 專利文獻4:國際公開第2011/070973號小冊子
[0021] 專利文獻5:日本特開2005-40073號公報
[0022] 專利文獻6:日本特開2002-315573號公報
[0023] 專利文獻7:日本特開2006-271395號公報
[0024] 非專利文獻
[00巧]非專利文獻 1:Stepo址US等，NaUire 345:170-172(1990)
[00%] 非專利文獻2:酒井昭，低溫生物工學會誌42:61-68( 1996)

【發(fā)明內容】

[0027] 發(fā)明要解決的技術問題
[0028] 因為專利文獻3提議的方法是在吸管中充滿玻璃化液，所W存在到達冷凍的時間 長的問題。同時，可W冷凍保存的細胞或組織的大小受到吸管內徑的限制，所W保存類似于 細胞片的片狀組織是困難的。
[0029] 專利文獻4提議的方法是通過除去附著在卵子或胚胎的周圍的多余的玻璃化液， 提議W高的生存率將運些生殖細胞冷凍保存的方法。然而，專利文獻4記載的方法因為在除 去多余的玻璃化液時需要從下部吸引操作，所W成為了煩雜的操作，在短時間內進行玻璃 化冷凍保存操作的情況下不合適。進一步地，如果從下部的吸引不充分，則存在多余的玻璃 化液殘存的問題。
[0030] 專利文獻5提議通過將附著在卵子或胚胎的周圍的多余的玻璃化液吸收至濾紙等 吸收體中，W高的生存性冷凍保存運些生殖細胞的方法。然而，通過Cryotop法，例如在玻璃 化保存法應用于人的卵子或胚胎的情況下，特別是W高精度要求卵子或胚胎對吸收體附著 確認作業(yè)的正確性，然而，因為濾紙全光線透射率低，在一般使用的透過型光學顯微鏡下觀 察吸收體上附著的卵子或胚胎是困難的，所W可靠地確認卵子或胚胎的附著是極其困難 的。而且，在冷凍保存后的融解作業(yè)時，也存在可靠地從吸收體上采集卵子或胚胎存在困難 的問題。
[0031] 專利文獻6、專利文獻7提議的方法在一定程度解決了專利文獻5所提議的方法的 不適合的問題。專利文獻6、專利文獻7所提議的方法操作性好，提供了不占有冷凍保存空間 的緊湊的卵冷凍保存用具。該卵冷凍保存用具配備有在顯微鏡下可W觀察人的卵子或胚胎 的柔性且無色透明的平坦的膜(卵附著固定用帶），通過在該膜上將極少量(0.化1)玻璃化 液和卵子或胚胎一起滴下附著，可W冷凍保存卵子或胚胎。但是，運些膜的寬度通常為0.5 ~2mm，如果操作不熟練，將極少量的含卵子或胚胎的玻璃化液正確滴下附著非常困難。實 際上眾多新手培養(yǎng)人員在卵子或胚胎的冷凍操作上首先受挫的是使用極少量液體將卵子 或胚胎放置于載片的操作。進一步地，在大量滴下玻璃化液的情況下，多余的玻璃化液在卵 子或胚胎的周圍殘留，由于玻璃化液自身的毒性，卵子或胚胎的生存性有降低的可能。因 此，需要有解決運些操作的難度和煩雜性的方法。
[0032] 本發(fā)明的主要課題是提供可W使細胞或組織的冷凍保存作業(yè)容易且可靠地進行 的玻璃化冷凍保存用工具。更具體地說，所述課題是提供玻璃化冷凍保存用工具，將細胞或 組織在玻璃化液中浸潰，在玻璃化液與細胞或組織一起在玻璃化液吸收體上滴下時，具備 為了吸收多余的玻璃化液的優(yōu)異的吸收性能，可W使用透過型光學顯微鏡W適宜的可見性 (附著確認性)觀察玻璃化液吸收體上的細胞或組織的玻璃化冷凍保存用工具。并且，本發(fā) 明除了具有為了吸收多余的玻璃化液的優(yōu)異的吸收性能W外，其課題進一步提供在冷凍保 存后的融解操作時，能夠W適宜的可見性觀察該玻璃化冷凍保存用工具上所放置的細胞或 組織的玻璃化冷凍保存用工具。
[0033] 解決技術問題的手段
[0034] 本發(fā)明者等為了解決上述課題而積極探討的結果發(fā)現(xiàn)，上述各種技術性課題可W 通過具有W下構成的細胞或組織的玻璃化冷凍保存用工具來解決。
[0035] (I)細胞或組織的玻璃化冷凍保存用工具，所述玻璃化冷凍保存用工具含有使用 折射率為