璃化液是可W通常用于卵子、胚胎等細(xì)胞的冷凍而使用的玻璃化液，例如可W使用上 述的含有甘油、乙二醇、DMSO(二甲基亞諷)等各種冷凍保護(hù)劑的水溶液。
[0076] 作為可W使用本發(fā)明的玻璃化冷凍保存用工具冷凍保存的細(xì)胞，可W列舉例如： 哺乳類(例如，人(人類）、牛、豬、馬、兔、大鼠、小鼠等）的卵子或胚胎、精子等生殖細(xì)胞；iPS 細(xì)胞;ES細(xì)胞。而且，可W列舉初代培養(yǎng)細(xì)胞、繼代培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞株細(xì)胞等培養(yǎng)細(xì)胞。而 且，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞可W列舉粘附性細(xì)胞，例如，成纖維細(xì)胞;來(lái)自于膜腺 癌、肝癌細(xì)胞等癌的細(xì)胞;上皮細(xì)胞;血管內(nèi)皮細(xì)胞;淋己管內(nèi)皮細(xì)胞;神經(jīng)細(xì)胞;軟骨細(xì)胞； 組織干細(xì)胞;胚性干細(xì)胞；W及免疫細(xì)胞等。進(jìn)一步地，作為可W冷凍保存的組織，可W列舉 由同種或異種細(xì)胞組成的組織，例如：卵巢、皮膚、角膜上皮、牙周膜、屯、肌、軟骨等組織。本 發(fā)明的玻璃化冷凍保存用工具不僅適用于直接從活體采集的細(xì)胞或組織，也適用于例如在 活體外培養(yǎng)增殖的培養(yǎng)皮膚、在活體外構(gòu)筑的所謂的細(xì)胞片、日本特開(kāi)2012-205516號(hào)公報(bào) 所記載的具有=維結(jié)構(gòu)的組織模型之類的人工組織的玻璃化冷凍保存。
[0077] 實(shí)施例
[0078] W下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)明示本發(fā)明，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明，然而，本發(fā)明不 限于W下實(shí)施例，在不偏離本發(fā)明的技術(shù)范圍的范圍內(nèi)，可W進(jìn)行各種各樣的變形和改變。
[0079] 實(shí)施例1
[0080] 通過(guò)電暈放電處理在表面進(jìn)行了易粘著處理的厚度250WI1、霧度值5.5%、全光線 透射率91%的透明PET膜上，作為粘著層，W干燥時(shí)質(zhì)量為lOg/m 2的量涂布了聚氨醋系粘著 物質(zhì)。在粘著層固化之前，作為多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，將通過(guò)拉伸制造的多孔質(zhì)膜的聚四氣乙締多 孔質(zhì)膜(折射率1.35,孔徑0.1皿，膜厚30WH，空隙率80%，經(jīng)聚乙締醇進(jìn)行親水化處理)疊合 在粘著層上干燥，制作了玻璃化液吸收體2。將此玻璃化液吸收體40mm 2與ABS (丙締臘-下二 締-苯乙締)樹(shù)脂制的手持部1接合，通過(guò)如圖1所示的實(shí)施方式制作了實(shí)施例1的玻璃化冷 凍保存用工具5。
[0081 ] 實(shí)施例2
[0082]作為多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，多孔質(zhì)膜的特征與實(shí)施例1不同，使用了比聚乙締醇更親水化 處理的聚四氣乙締多孔質(zhì)膜(折射率1.35,孔徑0.5皿，膜厚35皿，空隙率79%)，此外與實(shí)施 例1相同，制作了實(shí)施例2的玻璃化冷凍保存用工具。
[0083] 實(shí)施例3
[0084] 作為多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，多孔質(zhì)膜的特征與實(shí)施例1不同，使用了比聚乙締醇更親水化 處理的聚四氣乙締多孔質(zhì)膜(折射率1.35,孔徑1皿，膜厚85皿，空隙率80%)，此外與實(shí)施例 1相同，制作了實(shí)施例3的玻璃化冷凍保存用工具。
[0085] 實(shí)施例4
[0086] 作為多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，多孔質(zhì)膜的特征與實(shí)施例1不同，使用了比聚乙締醇更親水化 處理的聚四氣乙締多孔質(zhì)膜(折射率1.35,孔徑lOwn，膜厚85皿，空隙率80%)，此外與實(shí)施 例1相同，制作了實(shí)施例4的玻璃化冷凍保存用工具。
[0087] 實(shí)施例5
[0088] 作為多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，多孔質(zhì)膜的特征與實(shí)施例1不同，使用了比聚乙締醇更親水化 處理的聚偏二氣乙締多孔質(zhì)膜(折射率1.42,孔徑O.lwn，膜厚125WI1，空隙率70%)，此外與 實(shí)施例1相同，制作了實(shí)施例5的玻璃化冷凍保存用工具。
[0089] 實(shí)施例6
[0090] 作為多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，多孔質(zhì)膜的特征與實(shí)施例1不同，使用了比聚乙締醇更親水化 處理的聚偏二氣乙締多孔質(zhì)膜(折射率1.42,孔徑0.5WI1，膜厚125WI1，空隙率70%)，此外與 實(shí)施例1相同，制作了實(shí)施例6的玻璃化冷凍保存用工具。
[0091 ] 實(shí)施例7
[0092] 作為多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，多孔質(zhì)膜的特征與實(shí)施例1不同，使用了比聚乙締醇更親水化 處理的聚偏二氣乙締多孔質(zhì)膜(折射率1.42,孔徑扣m，膜厚125WH，空隙率70%)，此外與實(shí) 施例1相同，制作了實(shí)施例7的玻璃化冷凍保存用工具。
[0093] 比較例1
[0094] 作為多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，使用了醋酸纖維素多孔質(zhì)膜的日本7 Kパシテパ社制造的 醋酸纖維素膜(折射率1.47，孔徑0.5皿，膜厚125皿，空隙率68% )，此外與實(shí)施例1相同，審U 作了比較例1的玻璃化冷凍保存用工具。
[00巧]比較例2
[0096] 作為多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，使用了醋酸纖維素和硝化纖維素制成的多孔質(zhì)膜的日本7 K パシテッ夕社制造的纖維素混合醋膜(折射率1.51，孔徑0.5皿，膜厚145皿，空隙率78%)，此 外與實(shí)施例1相同，制作了比較例2的玻璃化冷凍保存用工具。
[0097] 比較例3
[0098] 作為多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，使用了親水化處理的聚乙締燒結(jié)微粒制成的多孔質(zhì)膜(折射 率1.51，孔徑43皿，膜厚500皿誼隙率42 % )，此外與實(shí)施例1相同，制作了比較例3的玻璃化 冷凍保存工具。
[0099] 比較例4
[0100] 作為多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，使用了在PET膜上，將氧化侶微粒(折射率1.65)和聚乙締醇 (PVA，折射率1.52~1.55)制成的粘合劑W90質(zhì)量％的氧化侶微粒和10質(zhì)量％的粘合劑的 比例混合的涂布層涂布形成的氧化侶多孔質(zhì)膜(孔徑0.0祉m，膜厚110皿，空隙率55%)，此 外與實(shí)施例1相同，制作了比較例4的玻璃化冷凍保存用工具。另外，因?yàn)檠趸瘋H多孔質(zhì)膜的 孔徑通過(guò)起泡點(diǎn)試驗(yàn)無(wú)法得到，所W通過(guò)水銀壓入法測(cè)定了孔分布，得到累積50 %直徑。
[0101] 比較例5
[0102] 使用了由纖維素纖維制成的濾紙日本7 Kパシテッ夕社制造的濾紙No.5C(折射率 1.50,每平方米的紙重120g/m2,密度0.57g/cm 3)作為玻璃化液吸收體，此外與實(shí)施例1相同， 制作了比較例5的玻璃化冷凍保存用工具。
[0103] 比較例6
[0104] 使用了無(wú)色透明的膜的透明PET膜(厚度250皿，全光線透射率91%，空隙率0%)作 為玻璃化液吸收體，此外與實(shí)施例1相同，制作了比較例6的玻璃化保存用工具。
[0105] 冷凍保存作業(yè)時(shí)的細(xì)胞的可見(jiàn)性的評(píng)價(jià)
[0106] 在實(shí)施例1~7和比較例1~6的各玻璃化冷凍保存用工具的玻璃化液吸收體上，將 含有玻璃珠(直徑lOOwn)作為細(xì)胞模擬物的玻璃化液化1 (微升)滴下附著。另外，玻璃化液 使用Sigma-Al化i Ch公司制造的改良TCM199培養(yǎng)基中包含20容積％血清、15容積％ DMSO、15 容積％乙二醇、0.2容積％薦糖所組成的玻璃化液。滴下附著后，使用透過(guò)型光學(xué)顯微鏡(奧 林己斯(株）制，SZH-121)，將是否可W觀察到在玻璃化液吸收體上滴下的細(xì)胞模擬物按照 W下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)。運(yùn)些結(jié)果顯示于表1的"冷凍保存作業(yè)時(shí)的細(xì)胞的可見(jiàn)性"的欄目。
[0107] 細(xì)胞的可見(jiàn)性按照W下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)。
[0108] ◎:可W容易地觀察細(xì)胞模擬物。
[0109] O :可W觀察細(xì)胞模擬物。
[0110] X :細(xì)胞模擬物的觀察困難或不能觀察細(xì)胞模擬物。
[0111] 玻璃化液的吸收性的評(píng)價(jià)1
[0112] 在實(shí)施例1~7和比較例1~6的各玻璃化冷凍保存用工具的玻璃化液吸收體上，將 含有玻璃珠(直徑1 OOmi)作為細(xì)胞模擬物的玻璃化液化1滴下附著。另外，玻璃化液使用 Sigma-Al化ich公司制造的改良TCM199培養(yǎng)基中包含20容積％血清、15容積％DMS0、15容 積％乙二醇、0.2容積％薦糖所組成的玻璃化液。滴下附著后，使用落射型光學(xué)顯微鏡(歐姆 龍(株)制，VC4500-S1)觀察細(xì)胞模擬物周邊的玻璃化液被吸收的樣子，按照W下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)。 運(yùn)些結(jié)果顯示于表1的"冷凍保存作業(yè)時(shí)的玻璃化液的吸收性(1 r的欄目。
[0113] 玻璃化液的吸收性的評(píng)價(jià)為按照下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0114] ◎:玻璃化液滴下附著后，10秒W內(nèi)玻璃化液被全部吸收。
[0115] 0:玻璃化液滴下附著后，10秒后，觀察到玻璃化液有殘留但被吸收的樣子。
[0116] X :玻璃化液滴下附著后，幾乎看不到、或者完全看不到玻璃化液的吸收。
[0117] 表1
[011 引
[0119] 實(shí)施例8
[0120] 作為多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，多孔質(zhì)膜的特征與實(shí)施例1不同，使用了比聚乙締醇更親水化 處理的聚四氣乙締多孔質(zhì)膜(折射率1.35,孔徑0.1皿，膜厚35皿，空隙率71%)，此外與實(shí)施 例1相同，制作了實(shí)施例8的玻璃化冷凍保存用工具。
[0121] 實(shí)施例9
[0122] 作為多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，多孔質(zhì)膜的特征與實(shí)施例1不同，使用了比聚乙締醇更親水化 處理的聚四氣乙締多孔質(zhì)膜(折射率1.35,孔徑0.2皿，膜厚35皿，空隙率71%)，此外與實(shí)施 例1相同，制作了實(shí)施例9的玻璃化冷凍保存用工具。
[0123] 實(shí)施例10
[0124] 作為多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)體，多孔質(zhì)膜的特征與實(shí)施例1不同，使用了比聚乙締醇更親水化 處理的聚四氣乙締多孔質(zhì)膜(折射率1.35,孔徑0.5皿，膜厚65皿，空隙率79%)，此外與實(shí)施 例1相同，制作了實(shí)施例10的玻璃化冷凍保存用工具。
[0125] 玻璃化液的吸收性的評(píng)價(jià)2
[0126] 在上述實(shí)施例3、實(shí)施例6、實(shí)施例8~10、比較例1、比較例2、比較例5和比較例6的 各玻璃化冷凍保存用工具的玻璃化液吸收體上，將含有