33(d，J = 4.細(xì)z，lH)，2.82(s，3H)，1.68(s，細(xì)）.
[0099] 對PUK- 丫脂質(zhì)激酶的體外效能
[0100] 實(shí)施例3.PI3K抑制試驗
[0101] 使用來自Beckman Coulter的Biomek FX，將10個100%DMS0中2.5倍連續(xù)稀釋的本 發(fā)明化合物各1.扣L加入到96孔聚苯乙締平板[Corning,Costar Item No.3697]的單個孔 中（后面稱為"測試孔"）。一個測試孔還含有1.扣L不含化合物的DMS0。另一個孔在DMSO中含 有已知能完全抑制酶的濃度的抑制劑（后面稱為"背景孔"）。使用Titedek Multidrop,將 50化反應(yīng)混合物[IOOmM 肥陽S pH 7.5,50mM NaCiaomM DTT，0.2mg/mL BSA，6化1 憐脂酷 肌醇（4,5)二憐酸醋山(：16。1(4,5沖2;4￥日11^?01日'^91(13，〔日1.齡.840046?)和關(guān)注的 PI3K同工型（同工型的濃度參見表1)]加入到各個孔中。為啟動反應(yīng)，將50化ATP混合物 [20mM MgCl2,6測ATP (100此i/皿01 33P-ATP)]加入到各個孔中，然后將各個孔在25 °C下溫 育30分鐘。各個孔的最終濃度為50mM肥陽S 7.5，10mM MgCl2,25mM化Cl，5mM DTT，0.1mg/ ml BSA，30iiM PI(4,5)P2,3iiM ATP和關(guān)注的PI3K同工型（參見表3)。各個孔中最終化合物濃 度為 lOiiM-lnM。
[0102] 表1 「AO1

[0104] 在溫育后，各個孔中的反應(yīng)通過加入50化終止溶液[30%TCA/水，IOmM ATP]澤滅。 然后將各個澤滅的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到96孔玻璃纖維濾板中[Corning ,Costar Item No. 3511]。將平板真空過濾，然后用150化的5%TCA/水在改良的Bio-Tek Instruments ELX-405自動平板洗涂器中洗涂3次。將50化閃爍流體加入各個孔中，并將平板在Perkin-Elmer TopCount? NXT液體閃爍計數(shù)器上讀數(shù)，從而獲得代表抑制值的33P-數(shù)。
[0105] 從各個測試孔獲得的數(shù)值中減去背景孔的數(shù)值，將數(shù)據(jù)擬合入Morrison和Stone, Comments Mol.Cell Biophys.2:347-368,1985中描述的競爭緊密結(jié)合Ki等式中?；衔? 的PI3K 丫抑制程度隨ATP濃度呈線性改變，顯示競爭性抑制，其中Ki值為8+/-4nM。此外，還 觀察到化合物1對?131(-〇、？131(-0、？131(-6同工型測試的同工型選擇性且確定對?131(丫15倍 W上的選擇性，如表2中所示。
[0106] 表2.化合物1的PI3K同工型選擇性
[0107]
[010引細(xì)胞效能
[0109] PI3K是由調(diào)節(jié)亞基和催化亞基組成的多亞基復(fù)合物。運(yùn)類酶催化憐脂酷肌醇-4， 5-二憐酸(PIP2)的憐酸化，得到第二信使憐脂酷肌醇-3,4,5-=憐酸(PIP3)。受體活化導(dǎo)致 PIP3水平瞬時增加。PIP3作為質(zhì)膜上的停泊位點(diǎn)起作用，從而補(bǔ)充和活化包含蛋白質(zhì)(例如 Akt、PDK-1、Tek激酶等）的普列克底物蛋白同源性(PH)結(jié)構(gòu)域。然后它們調(diào)節(jié)關(guān)鍵細(xì)胞功 能，例如生長、代謝、遷移、呼吸暴發(fā)等。當(dāng)下游效應(yīng)物在PI3K信號傳導(dǎo)途經(jīng)中是常見的時， 它是確定PI3K同工型在活化時補(bǔ)充的受體?；诖耍姸嗷谏?pAkt的和功能性試驗用 于分析PI3K 丫抑制劑相對于另外的PI3K同工型的效能和選擇性。
[0110] 實(shí)施例4. THP-I細(xì)胞中MCP-I刺激的pAkt
[0111] 趨化因子如MCP-I結(jié)合其受體，導(dǎo)致PI3K 丫信號傳導(dǎo)途經(jīng)活化。PI3K 丫導(dǎo)致PIP3生 成和下游分子(如PDK-I和Akt)活化。Akt憐酸化是細(xì)胞中PI3K活性的量度。在本試驗中，使 THP-I細(xì)胞(人單核細(xì)胞系)饑餓過夜，W耗盡pAkt水平。隨后用MCP-I刺激3分鐘導(dǎo)致PI3K 丫 誘導(dǎo)的蘇氨酸308和絲氨酸473位點(diǎn)上Akt的憐酸化。固定細(xì)胞，染色胞內(nèi)phosphoAKT (Ser473)，然后使用抓FACS化libur?細(xì)胞計數(shù)器分析，得到細(xì)胞PI3K 丫活性的測量值。在 本試驗中化合物1具有0.24 ± 0.07iiM的ICso。參見表3。
[0112] 表3.化合物1在PI3K-a/e/S依賴性體外試驗中的效能
[01"1
[0114] 實(shí)施例5.全血和白細(xì)胞突發(fā)性氧化作用試驗
[0115] 中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨隧細(xì)胞是先天免疫性的關(guān)鍵介體。它們釋放活性氧 (ROS)作為先天性免疫炎癥應(yīng)答的組成部分。ROS產(chǎn)生被炎癥介體誘導(dǎo)，如趨化因子、細(xì)菌膚 類和募集先天性免疫細(xì)胞至炎癥部位的補(bǔ)體。運(yùn)些炎癥介體觸發(fā)PI3K 丫活化并且啟動下游 信號傳導(dǎo)級聯(lián)，其導(dǎo)致在生成ROS的質(zhì)膜處完全NADPH氧化酶復(fù)合物裝配。根據(jù)生成的ROS確 定全血和棟黃層中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞中的PI3K 丫功能活性。用TNF-a將細(xì)胞刺激10分鐘， 然后用細(xì)菌細(xì)胞壁衍生的趨化性膚fMLP刺激20分鐘，并且加載非巧光染料二氨羅丹明1，2， S(DHR)。由細(xì)胞產(chǎn)生的ROS由此將D皿氧化成巧光羅丹明，導(dǎo)致細(xì)胞中的巧光羅丹明含量增 加。根據(jù)中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞在fMLP刺激后生成ROS的能力確定PI3K 丫功能活性。使用抓 FACS化libur?分析白細(xì)胞和全血樣品，W便對巧光羅丹明的細(xì)胞陽性定量。棟黃層細(xì)胞在 血清的存在下生成IC50S，并且全血試驗在不存在血清下生成IC50S?；衔?在棟黃層白細(xì)胞 試驗中具有0.的ICso并且在全血試驗中具有0.57iiM的ICso，參見表3。
[0116] 實(shí)施例6. THP-I細(xì)胞中CSF-I刺激的pAkt
[0117] 生長因子、細(xì)胞因子和其它受體酪氨酸激酶配體(如CSFl)結(jié)合其受體，導(dǎo)致IA類 PI3K信號傳導(dǎo)途經(jīng)活化。PI3K活化導(dǎo)致生成PIP3和下游分子(如PDK-I和Akt)活化。Akt憐酸 化是細(xì)胞中PI3K活性的量度。使THP-I細(xì)胞(人單核細(xì)胞系)饑餓過夜W耗盡pAkt水平。用 CSF-I刺激5分鐘導(dǎo)致PI3Ka/WS誘導(dǎo)的蘇氨酸308和絲氨酸473位點(diǎn)上Akt的憐酸化。固定細(xì) 胞，染色胞內(nèi)地OS地oAkt (Ser473)，然后使用抓FACS化1 ibur?細(xì)胞計數(shù)器分析。運(yùn)是細(xì)胞 IA類PI3K抑制的測量值。化合物1在本試驗中具有〉9.7咖的ICso,顯示于IA類PI3KS的選擇 性。參見表4。
[011引實(shí)施例7.人B細(xì)胞增殖試驗
[0119] B細(xì)胞的發(fā)育和活性高度依賴于PI3KSJI3K 丫通過B細(xì)胞受體(BCR)復(fù)合物在信號 傳導(dǎo)過程中具有必需和非多余的作用。IgM誘導(dǎo)的Ca+流入和增殖在缺乏PI3K-S或使用 PI3K-S抑制劑的小鼠中減弱。PI3K 丫在任何B細(xì)胞活性中都不起作用。BCR復(fù)合物對PI3K 丫 的特異性使得它成為用于評價PI3K 丫在細(xì)胞中抑制作用程度的理想的PI3K 丫試驗。在測試 化合物的存在下用抗-IgM刺激純化的人B細(xì)胞。4天后，使用cell titer-glo測量細(xì)胞存活 率/增殖率，W便測定各孔中細(xì)胞的ATP含量。增殖缺乏或減少是PI3K 丫抑制作用程度的測 量值?；衔?具有3.05 ± 0.44iiM的ICso，顯示11-倍于PI3K-S的選擇性窗。參見表4。
[0120] 實(shí)施例8. HUVEC增殖試驗
[0121] PI3KS是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、生長和細(xì)胞周期進(jìn)入的眾多生長因子下游的重要信號傳 導(dǎo)分子。PI3K-Q和PI3K-0同工型調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)入;抑制任一同工型導(dǎo)致細(xì)胞生長下降。 HUVECs是表達(dá)PI3Ka和PI3邸同工型的初級人廝靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。抑制PI3Ka或PI3郵同工型任 一種或它們兩者將抑制HUVECs細(xì)胞生長。將化合物在HUVECs上鋪展，化合物處理后96小時， 使用cell titer-glo測量細(xì)胞增殖率/存活率，W便測定各孔中細(xì)胞的ATP含量。增殖缺乏 或減少是PI3Ka和/或PI3郵抑制作用程度的巧慢值?；衔?在本試驗中具有〉19iiM的ICso, 顯示>74-倍于PI3Ka/e的選擇性。參見表4。
[0122] 實(shí)施例9.MCF-7增殖試驗
[0123] PUK-Akt信號傳導(dǎo)途經(jīng)調(diào)節(jié)許多正常細(xì)胞過程，包括細(xì)胞增殖、存活和生長，它們 對于腫瘤發(fā)生而言是關(guān)鍵的。PI3K信號傳導(dǎo)途經(jīng)失調(diào)通常發(fā)生在人癌中。MCF7是人乳腺癌 細(xì)胞系，其在PllOa蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)域中具有活化E545K PI3Ka雜合突變，導(dǎo)致PI3K-Q途徑 活動過度。抑制MC巧細(xì)胞中的PI3K-0信號傳導(dǎo)抑制細(xì)胞生長且由此可W在MC巧增殖試驗中 評價PI3K-Q抑制劑。將化合物加入到MCF7細(xì)胞中，化合物處理后96小時，使用cell titer-glo測量細(xì)胞增殖率/存活率，W便測定各孔中細(xì)胞的ATP含量。增殖缺乏或減少是PI3Ka抑 制作用程度的測量值?；衔?在本試驗中具有的ICso,由此顯示>67-倍于PI3Ka的選 擇性。參見表4。
[0124] 如上所述，化合物1具有極佳的效能，在PI3K 丫相關(guān)細(xì)胞試驗中為0.2扣M;在基于 細(xì)胞的試驗中具有12-倍于PI3K-S的選擇性;和40-80倍于PI3Ka和PI3K0的選擇性。
[0125] 表4.化合物1在PI3Ka/%/S依賴性體外試驗中的效能 [01261
[0127] * 每個試驗數(shù)據(jù)(山〇-〉20. >20，19.8
[0128] ** 每個試驗數(shù)據(jù)(iiM)-15.7，>20，18，17
[0129] 藥物代謝
[0130] 實(shí)施例10.重組CYP酶導(dǎo)致的化合物1代謝
[0131] 包含重組CYP酶化￥?142、286、2〔8、2〔9、2(：19、206、261和344)的微粒體用于測定該 CYP催化化合物1的氧化。因此，將化合物1 (化1)與各重組CYPs在輔因子NADPH的存在下一起 溫育。通過LC-MS/MS測定溫育期結(jié)束時剩余的母體藥物百分比并且與開始時存在的百分比 比較。結(jié)果如表5中所示。盡管是W低表觀率，但是僅在與CYP3A4-起溫育中檢測到化合物1 的代謝。
[0132] 表5.化合物1與重組CYP酶一起溫育的穩(wěn)定性*
[01331
[0134] *數(shù)據(jù)表示為平均值(SD)
[0135] 實(shí)施例11.化合物1對CYP酶的抑制
[0136] 評價人肝微粒體中化合物1(0.01-100咖)可逆地抑制〔￥?酶(〔￥?142、286、2〔8、 2C9、2C19、2D6和3A4)的潛能。抑制試驗W特定底物濃度(接近其解離常數(shù)化m)值)使用針對 每種CYP酶的選擇性CYP探針進(jìn)行。數(shù)據(jù)如表6中所示?；衔?是CYP1A2JB6和2C8的中度抑 制劑；ICsq值為4-7測。
[0137] 表6.化合物1對在人肝微粒體中的CYP酶的抑制 [013 引
[0139 ]還在人肝微粒體中采用I Cso轉(zhuǎn)移試驗評價使用化合物1對CYP3A4的時間依賴性抑 審IJ。在本研究中，將0.1-SOiiM的化合物1與人肝微粒體在NADPH的存在下和它不存在下一起 預(yù)溫育0和30分鐘。然后用緩沖液將溫育體系稀釋10-倍并且測定剩余CYP3A4(睪酬-6-0-徑 化酶)活性，歷時10分鐘期限。在NADPH的存在下或其不存在下化合物1的ICs誠有顯著性改 變(ICsq變化=1)。
[0140] 運(yùn)一結(jié)果在追蹤研究中得到驗證，其中在與10或SOiiM化合物1 一起預(yù)溫育后評價 人肝微粒體中的CYP3A4時間-依賴性抑制，歷時期限為0、5、10、15和30分鐘。本研究中，在兩 種濃度下，與陽性對照米非司酬的Kobs = 0.053/min相比，觀察到的CYP3A4活性缺失的速率 常數(shù)化Obs)為0.0039/min。來自運(yùn)些研究的兩個結(jié)果的數(shù)據(jù)顯示化合物1不W時間依賴性 方式抑制CYP3A4。
[0141] 實(shí)施例12.酶誘導(dǎo)
[0142] 在為人肝癌細(xì)胞系的DPX2細(xì)胞中Wo . l-30iiM的6個濃度評價化合物1活化孕燒-X 受體(PXR)的潛能，該細(xì)胞系中人P邸基因和連接至人CYP3A4基因的兩個啟動子的巧光素酶 報道基因被穩(wěn)定地超表達(dá)。將利福平用作陽性對照，化合物1顯示得到應(yīng)答的顯著活化水 平，其為具有EC50值〉30iiM的陽性對照的5%。
[0143] 還評價了在肝細(xì)胞中化合物1誘導(dǎo)CYP1A2和CYP3A4的潛能。將0.1-30iiM的化合物1 與培養(yǎng)的冷藏保存的來自3個不同供體的初級人肝細(xì)胞一起