壁上有一個(gè)液位計(jì)25，儲(chǔ)存容器3下端有一個(gè)液體流出口 28，出口處有一個(gè)截止閥31。本裝置還包括灌流泵4 ;熱交換器5，與熱交換器5配合使用恒溫水浴鍋35及熱循環(huán)泵36 ;氧合器6，可通入氧氣；去泡器7 ;帶蓋裝肝臟容器8，其上蓋上可安置灌流導(dǎo)管37，底部有液體流出口 33，流出口接有三通管39，三通管下面接截止閥34 ;回流泵9和廢液容器10。
[0026]根據(jù)灌流速度不同，用內(nèi)徑為6-10mm的軟管首先分別將灌流液儲(chǔ)存器1，2，3與四通管38連接，然后將四通管38剩余的一端與灌流泵4連接，然后依次連接熱交換器5，氧合器6和去泡器7，最后連接灌流導(dǎo)管37，連接到帶蓋裝肝臟容器8。之后，帶蓋裝肝臟容器8下方三通管33，帶截止閥34端用內(nèi)徑為6-10mm的軟管連接廢液容器10，三通管33另一段連接回流泵9，最后連接灌流液III儲(chǔ)存容器3上液體回流口 32。用內(nèi)徑為6_的軟管連接熱交換器5上熱循環(huán)水出入口與恒溫水浴鍋35和熱循環(huán)泵36。
[0027]本實(shí)用新型裝置的使用方法是這樣的:
[0028]以外科方式獲取正常巴馬豬完整肝臟，全肝臟重300克為例分離制備原代豬肝細(xì)胞的灌流過程為例，說明本裝置使用方法。
[0029]首先將全套設(shè)備分拆后滅菌，之后進(jìn)行無菌組裝。在三個(gè)灌流液儲(chǔ)存容器中分別加入過濾滅菌灌流液I 4-10L，灌流液II 1-2L和灌流液III 2-4L。將管路連接后，用灌流液I預(yù)灌注整個(gè)管路至去泡器出口。然后外科無菌條件下摘取完整的大動(dòng)物肝臟或人供肝組織，置于有蓋無菌容器中，將灌流導(dǎo)管與肝臟門靜脈系統(tǒng)聯(lián)通，之后灌流導(dǎo)管另一端與灌流裝置聯(lián)通。然后，開啟灌流泵以400-1000mL/min的速度將37°C加氧的灌流液I灌入肝臟，灌入肝臟的灌流液I從肝上下腔靜脈處溢出，最終流入廢液容器內(nèi)，棄去，灌流時(shí)間為10-12分鐘。此為第一步灌流，通過灌流液I沖洗肝內(nèi)血液，是殘留肝細(xì)胞盡可能沖洗干凈，同時(shí)初步松解肝細(xì)胞之間的連接。
[0030]其次，以400-1000mL/min的速度將37°C加氧的灌流液II灌入肝臟，灌入肝臟的灌流液II從肝上下腔靜脈處溢出，最終流入廢液容器內(nèi)，棄去，灌流時(shí)間為1-2分鐘。此為第二步灌流，通過灌流液II沖洗肝內(nèi)殘留灌流液I，去除灌流液I中膠原酶活性的抑制劑EGTA等成分，為酶消化做準(zhǔn)備。
[0031]最后，以500-1100mL/min的速度將37°C加氧的含有膠原酶的灌流液III灌入肝臟，灌入肝臟的灌流液III從肝上下腔靜脈處溢出，保存在裝有肝臟的無菌容器中，開啟回流泵以與灌流泵相同的速度將灌流液III抽回其原有儲(chǔ)存容器中，形成勻速循環(huán)灌流肝臟，25-40分鐘后，直至肝包膜與肝細(xì)胞分離，結(jié)束灌流。灌流液III流入廢液容器內(nèi)，棄去。此為第三步肝灌流，主要通過向肝內(nèi)循環(huán)灌注膠原酶，消化分解肝細(xì)胞之間的纖維連接，分離肝細(xì)胞。
[0032]之后將裝有肝臟的帶蓋容器從灌流裝置中取出，移入超凈工作臺(tái)中，進(jìn)入后續(xù)的肝細(xì)胞懸液收集及洗滌過程。所述肝細(xì)胞洗滌的過程為:首先，將預(yù)冷至4°C的Williams’ Medium E洗滌培養(yǎng)基，300-1000mL加入無菌盆中，用手術(shù)剪劃開肝包膜，分離未消化的肝組織和結(jié)締組織，收集肝細(xì)胞懸液。上述肝細(xì)胞懸液經(jīng)四層脫脂紗布過濾后，4°C條件下，離心力50-55Xg離心10分鐘。之后，棄去離心上清液，用4°C的Williams’MediumE洗滌培養(yǎng)基重懸沉淀的肝細(xì)胞，4°C條件下，離心力50-55 Xg離心10分鐘。將上述過程重復(fù)一次。最后，棄去離心上清液，沉淀肝細(xì)胞用無血清肝細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2-5X 107個(gè)每毫升，置冰浴中備用。
[0033]以上所述的灌流液I每升含有:8.3克氯化鈉，0.5克氯化鉀，2.4克HEPES，3_6gNAC, 0.9-1.1g EGTA,余量為去離子水；
[0034]灌流液II每升含有:8.3克氯化鈉，0.5克氯化鉀，2.4克HEPES，余量為去離子水；
[0035]灌流液III每升含有:3.9克氯化鈉，0.5克氯化鉀，24克HEPES，0.07克二水氯化鈣(CaCl2.2H20)，4克白蛋白，68-130PZ活性單位膠原酶，余量為去離子水。
[0036]Williams' Medium E 洗滌培養(yǎng)基每升中含有:9.5-10.8 克 Williams’Medium E 粉末，2.2克碳酸氫鈉，2.6克HEPES，0.1g鏈霉素，100000單位青霉素，余量為去離子水。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種體外肝灌流裝置，其特征在于:包括灌流液儲(chǔ)存容器組、四通管、灌流泵、熱交換系統(tǒng)、氧合器、去泡器、灌流導(dǎo)管、三通管和回流泵； 所述灌流液儲(chǔ)存容器組包括容器A、容器B和容器C，所述容器A、容器B、容器C均設(shè)有進(jìn)液口和帶有截止閥的出液口，所述容器C還設(shè)有回流口；所述灌流泵、熱交換器、氧合器、去泡器、灌流導(dǎo)管和回流泵均設(shè)有進(jìn)液口和出液口 ；所述四通管的四個(gè)管口分別與容器A的出液口、容器B的出液口、容器C的出液口和灌流泵的進(jìn)液口通過軟管相連；灌流泵的出液口與熱交換系統(tǒng)的進(jìn)液口、熱交換系統(tǒng)的出液口與氧合器的進(jìn)液口、氧合器的出液口與去泡器的進(jìn)液口、去泡器的進(jìn)液口與灌流導(dǎo)管的進(jìn)液口、回流泵的出液口與容器C的回流口均通過軟管相連； 所述灌流導(dǎo)管的出液口伸入裝肝臟容器中，所述裝肝臟容器的底部還設(shè)有出液口 ；所述三通管位于裝肝臟容器的下方，三通管的其中兩個(gè)管口分別通過軟管連接裝肝臟容器的出液口、回流泵的進(jìn)液口，三通管的第三個(gè)管口連接廢液管，所述廢液管上設(shè)有截止閥。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外肝灌流裝置，其特征在于: 所述容器A的進(jìn)液口、容器B的進(jìn)液口和容器C的進(jìn)液口均為帶液體滅菌濾膜的進(jìn)液漏斗，分別位于相應(yīng)容器的頂部； 所述容器A的出液口、容器B的出液口和容器C的出液口均位于底部； 所述容器A、容器B和容器C的頂部均設(shè)有帶空氣濾膜的透氣孔； 所述容器A、容器B和容器C均設(shè)有液位計(jì)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外肝灌流裝置，其特征在于:所述熱交換系統(tǒng)由熱交換器、熱循環(huán)泵和恒溫水浴鍋組成。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外肝灌流裝置，其特征在于:所述容器A的容積為4-10L，容器B的容積為1-2L，容器C的容積為2-4L。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的體外肝灌流裝置，其特征在于:所述裝肝臟容器帶有帽蓋。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的體外肝灌流裝置，其特征在于:所述軟管的內(nèi)徑為6mm_1mmο
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種體外肝灌流裝置，它包括由3個(gè)灌流液儲(chǔ)存容器構(gòu)成的灌流液儲(chǔ)存容器組、四通管、灌流泵、熱交換系統(tǒng)、氧合器、去泡器、灌流導(dǎo)管、三通管和回流泵。本實(shí)用新型可以對(duì)離體肝臟進(jìn)行三步肝灌流，最大限度地快速、連續(xù)進(jìn)行前灌流液和消化液的有效灌注，最大程度地質(zhì)控消化肝組織過程，節(jié)約成本，恒定溫度，減少污染，從而保質(zhì)保量的獲得實(shí)驗(yàn)與臨床所用的肝細(xì)胞，尤其是肝細(xì)胞移植、生物人工肝等所需的大量肝細(xì)胞。
【IPC分類】C12M1/02, C12M1/34
【公開號(hào)】CN204714806
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201520356633
【發(fā)明人】包驥, 步宏, 石毓君
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)華西醫(yī)院
【公開日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年5月28日