一種稀土熒光標(biāo)記的復(fù)合微球標(biāo)記物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及功能高分子生物材料技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種稀土熒光標(biāo)記的復(fù)合微球標(biāo)記物及其制備方法。作為性能優(yōu)異的熒光材料，稀土熒光微球標(biāo)記物可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)中，稀土離子或稀土配合物和二氧化硅摻雜的發(fā)光材料已有不少報道，如Cannasa (Cannasa.C，et a I ,Mat.Res.Soc.Symp.Proc.676(Y3) 18.1-18.6,2001)描述了一直用溶膠-凝膠法制備直接摻雜銪(Eu3+)的Y203-Si02納米發(fā)光材料;Moran等(C.E.Moranet al ,Langmuir 2001,17,8376-8379)合成了一直摻入Pr3+和Er3+的娃納米顆粒；程艷玲等(程艷玲等，應(yīng)用化學(xué)2008,25(10) ,1217-1220)以聚乙烯吡咯烷酮作穩(wěn)定劑，將單體苯乙烯通過超聲輻照分散聚合制得直徑在SOnm左右的聚苯乙烯納米微球。
[0003]現(xiàn)有的稀土熒光絡(luò)合物標(biāo)記物中，常用的熒光標(biāo)記物如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明-6_G(R-6-G)等，其熒光壽命普遍都比較短，長期的使用難以克服背景熒光的干擾，在其檢測中通常靈敏度都較低;其中的稀土離子主要是Eu3+、Sm3+、Dy3+和Tb3+同一些有機配合物如β-二酮化合物、鄰菲咯啉類化合物、水楊酸類化合物、聯(lián)吡啶類化合物等所形成絡(luò)合物，雖然目前已得到不同程度的應(yīng)用，但是都難以同時滿足一下要求:(I)、具有強烈的熒光；(2)、穩(wěn)定性好:包括熱力學(xué)穩(wěn)定和耐光漂白等；(3)、易于與抗體、核酸等生物大分子交聯(lián)，交聯(lián)后能同時保持標(biāo)記物的高熒光強度和被標(biāo)記物的生物活性；(4)易合成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種具有熒光壽命長、穩(wěn)定性好、易合成、成本較低和易標(biāo)記的一種稀土熒光標(biāo)記的復(fù)合微球標(biāo)記物及其制備方法。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:先將聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、過硫酸鉀(KPS)、苯乙烯(St)加入乙醇或水介質(zhì)中溶解后置于超聲波反應(yīng)器中，在氮氣的保護下聚合反應(yīng);在一定溫度下、且保持恒定的功率和氮氣氣流速，反應(yīng)一定時間后得到聚苯乙烯納米微球分散液;再利用帶有活性基團的有機硅烷在二氧化硅微球引入活性基團，再將稀土焚光絡(luò)合物4，4，-雙(1，1，1，2，2，3，3，h氣-4 , 6 , _己二酮基)氯橫基-鄰-二聯(lián)苯-銪(BHHCT-Eu3+)或4，7-二氯磺基苯-1，10菲咯啉-2，9二羧酸-銪(BCPDA-Eu3+)通過化學(xué)鍵合的形式固定于二氧化娃微球的表面，
[0006]而后在微球表面以帶有活性基團的有機硅烷再次引入活性基團，制成稀土熒光標(biāo)記的復(fù)合微球標(biāo)記物。
[0007]其制備方法包括以下步驟:
[0008](D、原材料預(yù)備:
[0009]按重量預(yù)備原材料:15-30g聚乙烯吡咯烷酮、0.03-0.1(^過硫酸鉀、8-128苯乙烯、80-120ml乙醇或水和4,4,-雙(I ,1,1,2,2,3,3t氣_4，6-己—■酬基)氣橫基_鄰-二聯(lián)苯；
[0010](2)、制備復(fù)合微球:
[0011]I)、制備氨基化納米微球:
[0012]將15-30g聚乙烯吡咯烷酮、0.03-0.1(^過硫酸鉀、8-128苯乙烯加入到80-1201111乙醇或水介質(zhì)中溶解后置于超聲波反應(yīng)器中，通氮氣排除體系中的氧氣，開啟超聲波發(fā)生器進行聚合反應(yīng)，在反應(yīng)6-10小時后得到聚苯乙烯納米微球分散液；
[0013]離心搜集聚苯乙稀納米微球，以5mL無水乙醇懸浮，加入5yL氨基娃燒，室溫攪拌反應(yīng)I小時，以等體積無水乙醇洗滌后收集；
[0014]2)、制備稀土熒光納米微球:
[0015]將4，4，-雙(I，I，I，2，2，3，3_七氟_4，6-己二酮基)氯磺基-鄰-三聯(lián)苯配制成Img/mL，按等體積加入到氨基化納米微球懸浮液中，室溫避攪拌15min，離心收集，懸浮于50mmol/L、pH值=7.8的磷酸鹽緩沖液中，加入等體積0.lmol/L氯化銪溶液，室溫避光攪拌反應(yīng)lOmin，
[0016]離心收集后懸浮于等體積無水乙醇溶液中，加入5yL氨基硅烷，室溫攪拌反應(yīng)I小時，以等體積無水乙醇洗滌后收集，即得到穩(wěn)定的稀土熒光標(biāo)記的復(fù)合微球標(biāo)記物。
[0017]其制備方法包括以下步驟:
[0018](D、原材料預(yù)備:
[0019]按重量預(yù)備原材料:15-30g聚乙烯吡咯烷酮、0.03-0.1(^過硫酸鉀、8-128苯乙烯、80-120ml乙醇或水和4，7-二氯磺基苯-1，10菲咯啉-2，9二羧酸；
[0020](2)、制備復(fù)合微球:
[0021]I)、制備氨基化納米微球:
[0022]將15-30g聚乙烯吡咯烷酮、0.03-0.1(^過硫酸鉀、8-128苯乙烯加入到80-1201111乙醇或水介質(zhì)中溶解后置于超聲波反應(yīng)器中，通氮氣排除體系中的氧氣，開啟超聲波發(fā)生器進行聚合反應(yīng)，在反應(yīng)6-10小時后得到聚苯乙烯納米微球分散液；
[0023]離心搜集聚苯乙稀納米微球，以5mL無水乙醇懸浮，加入5yL氨基娃燒，室溫攪拌反應(yīng)I小時，以等體積無水乙醇洗滌后收集；
[0024]2)、制備稀土熒光納米微球:
[0025]將4，7_二氯磺基苯-1，10菲咯啉_2，9二羧酸配制成lmg/mL，按等體積加入到氨基化納米微球懸浮液中，室溫避攪拌15min，離心收集，懸浮于50mmol/L、pH值=7.8的磷酸鹽緩沖液中，加入等體積0.lmol/L氯化銪溶液，室溫避光攪拌反應(yīng)1min，
[0026]離心收集后懸浮于等體積無水乙醇溶液中，加入5yL氨基硅烷，室溫攪拌反應(yīng)I小時，以等體積無水乙醇洗滌后收集，即得到穩(wěn)定的稀土熒光標(biāo)記的復(fù)合微球標(biāo)記物。
[0027]所述4，4，-雙(I，I，I，2，2，3，3_七氟_4，6_己二酮基)氯磺基_鄰-三聯(lián)苯或4，7_二氯磺基苯-1，10菲咯啉-2，9二羧酸與乙醇或水的體積比為3:1。
[0028]所述聚合反應(yīng)過程中通循環(huán)水維持的反應(yīng)溫度為60°C，且保持恒定的功率300W和恒定的氮氣氣流速。
[0029]本發(fā)明所述的稀土熒光標(biāo)記的復(fù)合微球標(biāo)記物中常用稀土離子主要有:銪、釤、鏑和鋱等，它們能與某些特定的配合物(β二酮類配體配合物，羧酸類配體配合物、鄰菲咯啉類配合物等)形成具有強烈熒光的絡(luò)合物;所形成的稀土熒光絡(luò)合物具有以下優(yōu)點:(I)、熒光壽命長:一般的焚光物質(zhì)及背景焚光的壽命約為I?10納秒，而稀土焚光絡(luò)合物的焚光壽命一般為10?1000微秒，兩者相差5?6個數(shù)量級；因此米用時間分辨焚光檢測技術(shù)，可以有效克服非特異性的背景熒光的干擾，極大地提高測量靈敏度；(2)、較寬的激發(fā)光譜帶:這有于增加激發(fā)能，提高標(biāo)記物的比活性；(3)、較窄的發(fā)射譜帶:半峰寬小于15納米，有利于提高分辨率；(4)、較大的Stokes位移(相同電子躍迀在吸收光譜和發(fā)射光譜中最強波長間的差值):稀土絡(luò)合物的最大激發(fā)光波長通常在300?380納米的紫外區(qū)，最大發(fā)射波長在500納米以上，Stokes位移達250?350納米，可有效排除各種背景熒光的干擾，增強檢測的特異性和靈敏度；(5)、激發(fā)波長具有配體(β二酮類配體配合物，羧酸類配體配合物、鄰菲咯啉類配合物等)的特性，激發(fā)波長隨著配體的不同而不同:即隨配體的變化而變化;發(fā)射波長具有稀土離子(銪、釤、鏑和鋱)的性質(zhì)，發(fā)射波長不隨著配體的變化而變化，而是隨著稀土離子的變化而稍有不同。
[0030]本發(fā)明中所述的稀土熒光標(biāo)記的復(fù)合微球是標(biāo)記有稀土熒光絡(luò)合物的復(fù)合微球；復(fù)合微球是由苯乙烯聚合而成，并摻雜有機硅烷水解產(chǎn)物;本發(fā)明提供的一種稀土熒光標(biāo)記的復(fù)合微球標(biāo)記物，與常規(guī)稀土熒光絡(luò)合物相比，具有下列優(yōu)點:(1)、具有更高的熒光強度和更高的穩(wěn)定性，更易于標(biāo)記，且制備簡單的摻雜有稀土熒光絡(luò)合物的復(fù)合微球標(biāo)記物；
(2)、其中的稀土熒光絡(luò)合物是以化學(xué)鍵合的形式摻雜于復(fù)合微球的表面?；瘜W(xué)鍵合是在微球形成之后進行的；(3)、能發(fā)出稀土離子的特征熒光。標(biāo)記的稀土熒光絡(luò)合物可以是4，7_二氯磺基苯-1，10菲咯啉-2，9二羧酸-銪(BCPDA-Eu3+)和4，4，-雙(I，I，I，2，2，3，3，-七氟_4，6，-己二酮基)氯磺基-鄰-三聯(lián)苯-銪(BHHCT-Eu3+)的一種或者兩種；(4)、其表面帶有活性基團，如氨基、羧基、巰基，這些基團是由帶有相應(yīng)基團的有機硅烷引入；(5)、可以用化學(xué)鍵合的作用將生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸、酶等標(biāo)記于熒光微球的表面；(6)、可以作為標(biāo)記物用于免疫檢測，核酸探針標(biāo)記等。
[0031 ]本發(fā)明的有益效果:該發(fā)明中，所使用的復(fù)合微球包含有多個稀土熒光絡(luò)合物，熒光強度得到極大提高，顯著減少了外部條件對熒光的淬滅效應(yīng)，使稀土熒光絡(luò)合物的熒光強度得到進一步提高;稀土熒光微球的熒光強度高于單個稀土熒光絡(luò)合物，這就避免了標(biāo)記單個稀土熒光絡(luò)合物時不得不采用多重標(biāo)記的麻煩。其穩(wěn)定性高于常規(guī)稀土熒光絡(luò)合物。在其表面引入了活性基團，可以與生物大分子進行方便的交聯(lián)，合成難度較小，且成本較低。具有常規(guī)熒光標(biāo)記物所不具有的長熒光壽命，又具常規(guī)稀土熒光絡(luò)合物所不具有的尚焚光強度、穩(wěn)定性和易標(biāo)記性。
[0032]利用具有長熒光壽命的稀土絡(luò)合物作為標(biāo)記物，采用時間分辨檢測技術(shù)，可以有效克服背景熒光的干擾，可使靈敏度有極大的提高。這種技術(shù)被稱為時間分辨熒光檢測技術(shù)，已成為目前生物醫(yī)學(xué)研究和臨床生化檢測中的常見技術(shù)