本發(fā)明屬于纖維素載體分離蛋白質(zhì)領(lǐng)域，具體涉及一種ni-羧酸磁性纖維素微球及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、對(duì)蛋白質(zhì)分析檢測(cè)在化學(xué)、生命科學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重要意義。蛋白質(zhì)種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其常與大量的干擾組分共存，如有機(jī)小分子、鹽及其他蛋白質(zhì)等，這對(duì)目標(biāo)蛋白的檢測(cè)造成了強(qiáng)烈干擾。對(duì)此，在檢測(cè)前蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)前，需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和提純。

2、目前，蛋白質(zhì)樣品前處理方法主要分為蛋白質(zhì)沉淀法、超濾法、液液萃取法以及固相萃取技術(shù)(spe)和磁固相萃取等。

3、蛋白質(zhì)沉淀法是通過添加特定試劑改變?nèi)芤涵h(huán)境，使蛋白質(zhì)沉淀，然后通過離心分離出來。此方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、效率高，但缺點(diǎn)在于選擇性較差，沉淀過程中可能會(huì)損失部分蛋白質(zhì)，且通常需要后續(xù)的純化步驟

4、超濾法利用濾膜的選擇性過濾作用，在外界壓力作用下，實(shí)現(xiàn)對(duì)大分子蛋白質(zhì)的濃縮和純化。這種方法操作簡(jiǎn)單，但超濾膜可能會(huì)被樣品中的污染物堵塞，影響其使用壽命和效率。

5、液液萃取法為基于物質(zhì)在兩種不相溶的溶劑中溶解度的差異，將蛋白質(zhì)從一種溶劑轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中。此方法雖然簡(jiǎn)單，但水-有機(jī)相的體系可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。

6、固相萃取技術(shù)(spe)通過固體色譜填料吸附樣品中的蛋白質(zhì)，再通過特定的溶劑洗脫，實(shí)現(xiàn)樣品的凈化和富集。spe技術(shù)可以自動(dòng)化操作，減少了操作步驟，且與磁性材料結(jié)合后，可以避免使用高壓和易堵塞的萃取柱，提高了分離效率。其中，磁固相萃取使磁性納米材料分散于基質(zhì)中，吸附劑與目標(biāo)蛋白的接觸面積大，能夠在低用量和短時(shí)間條件下完成對(duì)目標(biāo)蛋白的吸附及分離，提高了吸附效率。例如，fe3o4@au/mpa/nta-ni2+磁性納米粒子，通過表面修飾ni2+-nta配體吸附his標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。

7、在磁固相萃取中，ni2+-nta親和配體修飾的磁性顆粒在組氨酸標(biāo)簽蛋白純化中得到了廣泛關(guān)注。這些磁性顆粒憑著其大比表面積的優(yōu)勢(shì)從而增強(qiáng)了與蛋白質(zhì)的結(jié)合。

8、然而，目前ni2+-nta親和配體修飾的磁性顆粒仍存在不足之處：

9、磁性顆粒的直徑非常小，在表面能的影響下，這些磁性顆粒容易發(fā)生團(tuán)聚，影響磁性顆粒的磁性能和分散性。此外，裸露的磁性顆粒在空氣中容易發(fā)生氧化，導(dǎo)致磁性顆粒失去活性。

10、盡管現(xiàn)有技術(shù)對(duì)磁性顆粒進(jìn)行表面修飾，通過引入特定的官能團(tuán)或聚合物，減少顆粒之間的直接接觸，從而避免團(tuán)聚和氧化。但是，目前主要是可以通過硅烷偶聯(lián)劑、聚合物包覆或生物分子(如蛋白質(zhì)、多糖)修飾。上述的磁性顆粒修飾方式盡管能增強(qiáng)磁性顆粒在復(fù)雜環(huán)境中的穩(wěn)定性。然而，目前的修飾方式不能同時(shí)使ni2+接到磁性顆粒上，并且由于磁性顆粒表面修飾的為蛋白質(zhì)和多糖，不能較好地分離組氨酸標(biāo)簽蛋白，且具有成本高的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于避免現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處而提供一種ni-羧酸磁性纖維素微球及其制備方法，其能有效地防止磁性纖維素微球發(fā)生聚集和氧化的問題，具有分離組氨酸標(biāo)簽蛋白效果好和成本低的優(yōu)點(diǎn)。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的之一，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、提供ni-羧酸磁性纖維素微球的制備方法，包括以下步驟，

4、s1、將配方量纖維素粉分散于蒸餾水中，加入多元羧酸進(jìn)行酯化反應(yīng)，得到羧酸化纖維素；

5、s2、將羧酸化纖維素溶解在由naoh、尿素和水混合得到的naoh/尿素水溶液中，得到纖維素溶液；

6、s3、將配方量磁性fe3o4分散在所述纖維素溶液中，得到混合物；

7、將所述混合物投入由span?80、吐溫80和液體石蠟混合得到的乳化體系中，繼續(xù)攪拌均勻，得到羧酸磁性纖維素微球，清洗所述羧酸磁性纖維素微球；

8、s4、將羧酸磁性纖維素微球加入niso4溶液中發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)完成后，使用去離子水洗滌以除去剩余niso4，得到ni-羧酸磁性纖維素微球。

9、在一些實(shí)施方式中，酯化反應(yīng)中還加入磷酸二氫鈉，所述酯化反應(yīng)過程使用去離子水超聲反應(yīng)，于110℃～130℃下酯化80min～100min，待冷卻后用去離子水多次洗滌。

10、在一些實(shí)施方式中，所述多元羧酸為1,2,3,4-丁烷四羧酸或檸檬酸；

11、纖維素粉、多元羧酸與所述磷酸二氫鈉的重量之比為1～1.5:0.1～0.5:0.2。

12、在一些實(shí)施方式中，所述naoh、尿素和水的重量之比是(1～8):(6～14):(78～93)，

13、所述羧酸化纖維素與所述naoh/尿素水溶液的重量之比為1～2:30～60。

14、在一些實(shí)施方式中，所述磁性fe3o4與所述纖維素溶液的重量之比為0.5～1:2～4。

15、在一些實(shí)施方式中，所述niso4溶液濃度為0.4m～0.6m，每克羧酸磁性纖維素微球加入所述niso4溶液的量為35ml～50ml。

16、在一些實(shí)施方式中，溶解時(shí)，在-12℃～-15℃溫度下預(yù)冷15min，隨后以300～500r/min的攪拌速度溶脹羧酸化纖維素，以3000r/min的攪拌速度溶解15min～30min。

17、在一些實(shí)施方式中，所述span?80、吐溫80和液體石蠟的用量之比分別為1～5:1～3:100～200；

18、所述混合物投入乳化體系后，攪拌溫度為25℃～45℃，攪拌速度為500r/min～1000r/min，攪拌時(shí)間為120min～240min。

19、在一些實(shí)施方式中，依次使用sds溶液、乙醇清洗所述ni-羧酸磁性纖維素微球。

20、為實(shí)現(xiàn)上述目的之二，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:

21、還提供ni-羧酸磁性纖維素微球，所述ni-羧酸磁性纖維素微球通過上述的制備方法制得。

22、本發(fā)明一種ni-羧酸磁性纖維素微球的制備方法的有益效果:

23、本發(fā)明一種ni-羧酸磁性纖維素微球的制備方法，先通過酯化反應(yīng)使纖維素粉反應(yīng)為羧酸化纖維素，隨后采用naoh/尿素水溶液溶解羧酸化纖維素，naoh/尿素水溶液中的naoh水合物分子與解羧酸化纖維素中的纖維素分子鏈進(jìn)行結(jié)合，naoh水合物分子在羧酸化纖維素分子鏈形成氫鍵，破壞羧酸化纖維素分子鏈原有的氫鍵結(jié)構(gòu)，使得羧酸化纖維素溶解；同時(shí)，naoh/尿素水溶液中的尿素抑制游離的羧酸化纖維素分子鏈重新聚集，提高了羧酸化纖維素分子鏈的溶解效率，以便后續(xù)羧酸化纖維素包裹磁性粒子。

24、由span?80、吐溫80和液體石蠟組成的乳化體系來分散磁性fe3o4與纖維素溶液混合的混合物，該乳化體系中的span?80、吐溫80作為表面活性劑，液體石蠟則為油相，纖維素在極性相反的乳化體系中將纖維素溶液則能分散為大小均勻且直徑約為十至數(shù)百微米的微球，容易操作，成本低。

25、該尺寸的微球能夠有效地細(xì)化磁性顆粒尺寸，進(jìn)一步地提高了磁性顆粒的比表面積，提高ni-羧酸磁性纖維素微球分離蛋白質(zhì)的效率。

26、此外，纖維素溶液通過包覆在磁性顆粒表面，能有效地防止磁性顆粒發(fā)生氧化，提高了磁性顆粒功能穩(wěn)定性，纖維素附著在磁性顆粒表面還降低各磁性顆粒的表面能和表面活性，避免磁性顆粒發(fā)生聚集問題，保證磁性顆粒的分離功能。

27、纖維素具有大量羥基，經(jīng)多元羧酸改性后，改性纖維素的羧基將ni快速地穩(wěn)定地附著其表面上，該纖維素不但實(shí)現(xiàn)包裹磁性顆粒避免磁性顆粒發(fā)生聚焦，而且無需額外修飾磁性顆粒，有效地改善了磁性顆粒的性能，且具有成本低的優(yōu)點(diǎn)。