品液，在其兩側(cè)流動(dòng))；
[0121]c)光照射區(qū)域，位于上述合流流道上；
[0122]d) 一對(duì)對(duì)置的分支流道，在與光照射區(qū)域相比的下游處，(幾乎成直角地)連接于上述合流流道上。
[0123]典型地，在上述一對(duì)對(duì)置的分支流道的一個(gè)流道上連接通常為關(guān)閉狀態(tài)的第一電磁閥和負(fù)壓的定壓泵；在上述一對(duì)對(duì)置的分支流道的另一個(gè)流道上連接通常為關(guān)閉狀態(tài)的第二電磁閥和正壓的定壓泵。
[0124]典型地，上述檢測(cè)裝置對(duì)上述粒子通過(guò)光照射區(qū)域時(shí)所產(chǎn)生的光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。
[0125]典型地，上述控制部基于來(lái)自上述檢測(cè)裝置的上述光信號(hào)，判斷上述微粒是否為應(yīng)分離的目標(biāo)微粒，如果判斷為是應(yīng)分離的目標(biāo)微粒的情況下，在該微粒通過(guò)與上述一對(duì)對(duì)置的分支流道連接的上述合流流道的區(qū)域中，對(duì)上述第一及第二電磁閥提供僅短時(shí)間呈開(kāi)啟狀態(tài)的信號(hào)，對(duì)從上述對(duì)置的一對(duì)分支流道通過(guò)上述區(qū)域的上述目標(biāo)微粒施加推(PUSH)及拉(PULL)的壓力。這樣一來(lái)，通過(guò)改變上述目標(biāo)微粒流，從而能夠?qū)⒛繕?biāo)微粒從其它微粒中分離出來(lái)。
[0126]或者也可以是，在本發(fā)明的微粒分離裝置中，上述控制部，在判斷上述微粒為應(yīng)分離的目標(biāo)微粒的情況下，在該微粒通過(guò)與上述一對(duì)對(duì)置的分支流道連接的合流流道區(qū)域中，對(duì)上述電磁閥提供只是短時(shí)間作為開(kāi)啟狀態(tài)的信號(hào)；據(jù)此，對(duì)存在于上述對(duì)置的分支流道間的合流流道區(qū)域中的目標(biāo)微粒施加推及拉的壓力，改變上述目標(biāo)微粒流，將目標(biāo)微粒收入“拉”側(cè)的分支流道。
[0127]本發(fā)明的微粒分離裝置，其流動(dòng)室還可以具有一對(duì)追加的分支流道，所述一對(duì)追加的分支流道是在與一對(duì)對(duì)置的分支流道連接的合流流道區(qū)域相比更下游處，從合流流道分支出的。并且，利用上述控制部判斷微粒為應(yīng)分離的目標(biāo)微粒的情況下，在該微粒通過(guò)最初一對(duì)分支流道相對(duì)且最初的分支流道連接的合流流道的上述區(qū)域中，對(duì)上述電磁閥提供只是短時(shí)間作為開(kāi)啟狀態(tài)的信號(hào)，據(jù)此，對(duì)存在于對(duì)置的最初的分支流道間的合流流道區(qū)域中的目標(biāo)微粒施加推及拉的壓力，改變目標(biāo)微粒流，將目標(biāo)微粒分離到下游的追加的分支流路中，從而能夠分離微粒。
[0128]2.平板狀流動(dòng)室裝置
[0129]在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，提供一種平板狀的流動(dòng)室裝置，其用于在將樣品液在流道內(nèi)流動(dòng)的狀態(tài)，分離包含在樣品液中的微粒。該流動(dòng)室裝置，典型地具有如下結(jié)構(gòu):在透明基板中形成有流道，在該流道的上游側(cè)與下游側(cè)的基板上分別形成與上述流道進(jìn)行流體連接(fluidly connected)的液室。
[0130]更具體地，該流動(dòng)室裝置，其具有形成于透明基板上的:
[0131]i)樣品液導(dǎo)入用流道和設(shè)置在其兩側(cè)的一對(duì)鞘液導(dǎo)入用流道；
[0132]ii)合流流道，是上述樣品液的導(dǎo)入用流道與設(shè)置在其兩側(cè)的上述一對(duì)鞘液導(dǎo)入用流道合流而成，鞘液夾著上述樣品液，在其兩側(cè)流動(dòng)；
[0133]iii)對(duì)置的一對(duì)分支流道，(幾乎成直角地)連接于上述合流流道的側(cè)面。
[0134]iv)上述一對(duì)分支流道具有能夠與外部泵進(jìn)行氣密連接的端口。
[0135]流動(dòng)室結(jié)構(gòu)還可以是具有一對(duì)追加的分支流道，所述一對(duì)追加的分支流道是在與上述分支流道連接的上述合流流道區(qū)域相比更下游處，從上述合流流道分支出的。
[0136]3.應(yīng)對(duì)多個(gè)待測(cè)樣品的流式細(xì)胞儀。
[0137]在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方式中，提供一種應(yīng)對(duì)多個(gè)待測(cè)樣品的流式細(xì)胞儀，其用于將包含生物粒子的樣品液在流動(dòng)室的流道內(nèi)流動(dòng)的狀態(tài)下，對(duì)樣品液照射光，檢測(cè)由包含在樣品液中的樣品粒子所產(chǎn)生的光。該流式細(xì)胞儀典型地具有:
[0138]i)載置臺(tái)，載置流動(dòng)室；
[0139]ii)光照射裝置；
[0140]iii)檢測(cè)裝置，檢測(cè)生物粒子；
[0141]iv)控制部，控制上述各部的動(dòng)作。
[0142]上述流動(dòng)室也可以是平板狀。進(jìn)一步地，上述流動(dòng)室也可以在透明的平板基板上形成有多個(gè)樣品液貯液室及多個(gè)鞘液貯液室、多個(gè)廢液貯液室及多個(gè)回收樣品液貯液室，以及與這些貯液室分別流體連接的多個(gè)流道。進(jìn)一步地，各上述樣品液貯液室也可以在各上述鞘液貯液室內(nèi)隔開(kāi)形成，以避免各自液體相混合。進(jìn)一步地，各上述樣品液貯液室上也可以連接各樣品液用流道；進(jìn)一步地，各上述鞘液貯液室上也可以連接一對(duì)鞘液用流道。進(jìn)一步地，各上述樣品液流道的側(cè)面上也可以連接上述一對(duì)鞘液用流道。
[0143]也可以采用以下結(jié)構(gòu)，通過(guò)在各樣品液流道上連接上述一對(duì)鞘液用流道，從而形成從上述樣品液流的左右合流鞘流的流道，合流后的流道以平行的等間距形成，最下游連接到形成于流動(dòng)室上的上述廢液貯液室及上述回收樣品貯液室上。
[0144]根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)對(duì)多個(gè)待測(cè)樣品的流式細(xì)胞儀，在多個(gè)上述流道的每一個(gè)上，利用使只能照射一個(gè)流道大小的光束依次以步進(jìn)重復(fù)(step and repeat)方式照射光或流動(dòng)室移動(dòng)，來(lái)檢測(cè)多個(gè)樣品。
[0145]在本發(fā)明的應(yīng)對(duì)多個(gè)待測(cè)樣品的流式細(xì)胞儀中，也可以通過(guò)使上述流動(dòng)室的上述透明平板基板的上述流道側(cè)面方向的兩端傾斜，從而使從各上述流道內(nèi)產(chǎn)生的側(cè)方散射光在兩端全反射，并導(dǎo)入檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。
[0146]4.其它流式細(xì)胞儀
[0147]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供一種流式細(xì)胞儀，其特征在于，在分析包含多個(gè)熒光分子的細(xì)胞時(shí)，具有如下功能:將由光照射產(chǎn)生的波長(zhǎng)不同的兩種熒光強(qiáng)度的比，對(duì)每個(gè)細(xì)胞顯示分布；根據(jù)其值來(lái)評(píng)價(jià)包含在細(xì)胞中的多個(gè)熒光分子的豐度。此外，在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供一種生物粒子分析裝置，其特征在于，在對(duì)同時(shí)使用透過(guò)細(xì)胞膜的染色劑與不透過(guò)細(xì)胞膜的染色劑染色的細(xì)胞或細(xì)菌進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，對(duì)于由激光照射產(chǎn)生的波長(zhǎng)不同的兩種熒光信號(hào)強(qiáng)度的比，根據(jù)其相對(duì)于之前設(shè)定的基準(zhǔn)值的大小關(guān)系，來(lái)判定是死細(xì)胞還是活細(xì)胞。
[0148]這些流式細(xì)胞儀或生物粒子分析裝置，典型地至少具有激光照射光源和熒光測(cè)定裝置，所述熒光測(cè)定裝置的構(gòu)成為檢測(cè)多個(gè)波長(zhǎng)區(qū)域的熒光。
[0149]下面，參照附圖，對(duì)本發(fā)明的更具體的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明的范圍并不限定于這些實(shí)施方式。
[0150]I)細(xì)胞分離方法及裝置。
[0151]使用圖1詳細(xì)說(shuō)明實(shí)現(xiàn)一次性芯片內(nèi)的細(xì)胞分離的本發(fā)明的細(xì)胞分離方法及裝置。圖1(A)圖示了在從細(xì)胞分選流道100施加壓力的情況下，該壓力引起的液流，所述細(xì)胞分選流道100為在側(cè)面連接到細(xì)胞流動(dòng)的主流道上。在與流道中的壓力相比足夠低的負(fù)壓的情況下，液流被拉入(“拉(PULL) ”狀態(tài))。在與流道中的壓力相比足夠高的情況下，液流被推出(“推(PUSH)”狀態(tài))。目標(biāo)細(xì)胞在主流道中流動(dòng)并橫穿分選流道的瞬間，施加拉或推的壓力時(shí)，僅移動(dòng)目標(biāo)細(xì)胞是不可能的。即，在利用壓力僅將特定的細(xì)胞分離到分離流道的情況下，由于力會(huì)波及到大范圍的液體，使分離的空間分辨率變差。
[0152]作為解決上述問(wèn)題的方法，如圖1(B)中所示，在主流道的側(cè)面對(duì)置設(shè)置用于推和用于拉的分選流道，通常，主流道和分選流道之間不存在液流，但僅在應(yīng)分離的目標(biāo)細(xì)胞通過(guò)對(duì)置區(qū)域內(nèi)的時(shí)間，產(chǎn)生推的壓力和拉的壓力。這種情況下，使推的流量與拉的流量幾乎相同，將來(lái)自分選流道的壓力影響主流道流體的區(qū)域大致限定在分選流道寬度上。該方法如圖2所示。
[0153]在圖2中，包含細(xì)胞的樣品溶液在形成于流動(dòng)室內(nèi)的流道I中流動(dòng)，不包含細(xì)胞的鞘液在流道2中流動(dòng)，通過(guò)合流，樣品液以擰細(xì)的狀態(tài)流動(dòng)。在該樣品流動(dòng)的流道的側(cè)面對(duì)置連接有兩個(gè)分支流道4-1、4-2。流道4-1為用于拉的流道，流道4-2為用于推的流道。在流道4-1上連接有儲(chǔ)存目標(biāo)細(xì)胞的貯液室5、電磁閥7-1及氣缸泵8-1。氣缸泵8-1保持與流道I相比足夠低的一定的壓力，另一方面，在推的流道上連接有電磁閥7-2與氣缸泵8-2。氣缸泵8-2保持與流道I相比足夠高的一定的壓力。包含在樣品液中的細(xì)胞通過(guò)激光照射區(qū)域3時(shí)，由細(xì)胞產(chǎn)生散射光及熒光。用光檢測(cè)器檢測(cè)上述光，對(duì)其信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行定量化，并與預(yù)先設(shè)定的所需細(xì)胞的信號(hào)條件進(jìn)行比較。通過(guò)信號(hào)處理線路判定該細(xì)胞是否為所需細(xì)胞，如果是所需細(xì)胞的情況下，在該細(xì)胞通過(guò)分支流道的時(shí)間里，產(chǎn)生觸發(fā)信號(hào)，根據(jù)該觸發(fā)信號(hào)，使電磁閥7-1與7-2僅短時(shí)間呈開(kāi)啟狀態(tài)。在開(kāi)啟狀態(tài)期間，從流道4-2向主流道提供與從主流道向分支流道4-1流入的流量相同的流量，從而限定流道4-1與流道4-2之間的分選流，防止細(xì)胞分離的空間分辨率比流道4-1的寬度差。在上述方式中，作為產(chǎn)生脈沖壓力的方法，通過(guò)連接定壓泵與電磁閥，來(lái)獨(dú)立控制分選力與分選產(chǎn)生時(shí)間長(zhǎng)短。由于定壓泵不產(chǎn)生氣溶膠，因此適合用于生物危害。
[0154]圖3為基于推&拉的流速比流道27的流速慢，不能夠放入分選貯液室5的情況下進(jìn)行分離的方法。圖3a)表示電磁閥為關(guān)閉(OFF)的情況。在下游側(cè)與流道1、2對(duì)稱(chēng)地形成流道11、23、24。為了達(dá)到在層流上的流體力學(xué)效果，鞘液分離到流道23、24中，樣品液I回收至流道11。圖3b)表示電磁閥開(kāi)啟(ON)的情況。這種情況下，目標(biāo)細(xì)胞因來(lái)自分選流道4-1、4-2的壓力而產(chǎn)生的液流中，位置稍微從流道4-1偏移，并在流道27中流動(dòng)。在下游側(cè)，通過(guò)該偏移，目標(biāo)細(xì)胞分離到流道23中。
[0155]根據(jù)需要，為了避免細(xì)胞或細(xì)菌流入電磁閥，設(shè)置過(guò)濾器，從而能夠起到防止由流動(dòng)室外部向流道內(nèi)混入細(xì)菌或細(xì)胞，防止樣品向流動(dòng)室外部散失的作用。
[0156]下面，使用圖4及圖5，對(duì)實(shí)現(xiàn)一次性芯片內(nèi)的細(xì)胞分離的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。
[0157]圖4表示在一次性芯片型流動(dòng)室上連接氣缸泵和電磁閥的狀態(tài)。一次性芯片的結(jié)構(gòu)是在作為現(xiàn)有發(fā)明的專(zhuān)利文獻(xiàn)14中記載的基礎(chǔ)上，對(duì)稱(chēng)增加了圖2所示的分選用流道4-1和流道4-2和各自的分選貯液室5-1、5-2。一次性芯片型流動(dòng)室用透明樹(shù)脂制成。作為樹(shù)脂的種類(lèi)，可以使用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、環(huán)烯烴共聚物(COC)、甲基戊烯聚合物等。尤其在使用波長(zhǎng)為350nm至410nm左右的UV波長(zhǎng)區(qū)域的激光作為照射光源的情況下，作為流動(dòng)室的原料適合使用甲基戊烯聚合物。作為將分選貯液室也設(shè)置在流道4-2上的對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，連接電磁閥與氣缸泵。對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)是為了在電磁閥開(kāi)啟時(shí)，在同一時(shí)間，將相同的壓力施加到流道27上。
[0158]圖5進(jìn)一步表示了光學(xué)系統(tǒng)與控制系統(tǒng)電路間的連接關(guān)系。芯片的截面圖為圖4的BB截面。如圖4所示，通過(guò)對(duì)芯片的上游側(cè)施加氣壓，樣品液與鞘液同時(shí)流入流道27，對(duì)比對(duì)置的分選流道4-1、4-2的區(qū)域稍上游的主流道的中央部照射激光52。細(xì)胞在通過(guò)該照射區(qū)域的瞬間，以脈沖形式產(chǎn)生散射光和熒光。散射光根據(jù)二向色鏡(di chroicmirror) 54和帶通濾波器57，選擇與照射激光相同的波長(zhǎng)，用檢測(cè)器61檢測(cè)。在檢測(cè)器61的前面設(shè)置遮光板60，消除激光透射光。熒光根據(jù)二向色鏡55、56與帶通濾波器58、59，用比照射激光長(zhǎng)的波長(zhǎng)，分割成多個(gè)波長(zhǎng)區(qū)域，分別用不同的檢測(cè)器62、63檢測(cè)。各檢測(cè)脈沖信號(hào)擴(kuò)增并利用AD轉(zhuǎn)換電路64數(shù)字化，利用微型計(jì)算機(jī)69判斷多個(gè)檢測(cè)信號(hào)是否滿足預(yù)先設(shè)定的分離條件，在滿足的情況下，在一定延遲時(shí)間后，將觸發(fā)信號(hào)輸出到電磁閥驅(qū)動(dòng)66。將該延遲時(shí)間調(diào)整為細(xì)胞從激光照射區(qū)域流到分選流道4-1、4-2的區(qū)域?yàn)橹沟臅r(shí)間。收到觸發(fā)信號(hào)的電磁閥驅(qū)動(dòng)66，向電磁閥7-1、7_2輸出僅開(kāi)啟一定時(shí)間的信號(hào)。將流道4-1和流道4-2的寬度設(shè)為相等的W，將細(xì)胞流經(jīng)流道27的流速設(shè)為V，則閥為開(kāi)啟狀態(tài)的時(shí)間長(zhǎng)短優(yōu)選設(shè)定為W/V(秒)。電磁閥開(kāi)啟時(shí)，目標(biāo)細(xì)胞流入分選貯液室5。主流道與分選流道之間的液流，在閥7-1與閥7-2為關(guān)閉狀態(tài)下不發(fā)生，因此一旦收入分選貯液室5中的目標(biāo)細(xì)胞在該處中被穩(wěn)定地保存。
[0159]如圖4