所示，在芯片上游側(cè)的貯液室20的內(nèi)部，雖然圖中沒有示出，但其通過定壓泵施加了一定的氣壓。貯液室20的內(nèi)部具有樣品液貯液室10，在其內(nèi)側(cè)加入樣品液，在其外側(cè)加入鞘液。作為鞘液，優(yōu)選使用磷酸鹽緩沖液(PBS)。利用共通的氣壓，樣品液I與其左右的鞘液2向下游流動(dòng)，待3條流道合流后，以樣品液被鞘液擰細(xì)的狀態(tài)在流道27中流動(dòng)。流道27的寬度為80 μ m，深度為50 μ m。合流后的樣品液寬度約為流道寬度的1/10。流道27具有從側(cè)面對(duì)置的流道4-1、4-2，該流道與貯液室5連接。將波長(zhǎng)為488nm的激光52照射到比該對(duì)置區(qū)域更上游側(cè)僅數(shù)百ym處的流道27的中央部。上述光束大小為長(zhǎng)度為50 μ m、寬度為20 μ m的橢圓。
[0160]細(xì)胞在通過該照射區(qū)域的瞬間，以脈沖形式產(chǎn)生散射光和熒光。散射光利用二向色鏡54和帶通濾波器57，選擇與照射激光相同的波長(zhǎng)，用檢測(cè)器61檢測(cè)。在檢測(cè)器61的前面設(shè)置遮光板60，消除激光透射光。熒光利用二向色鏡55、56和帶通濾波器58、59，用比照射激光長(zhǎng)的波長(zhǎng)，分割成多個(gè)波長(zhǎng)區(qū)域，分別用不同的檢測(cè)器62、63檢測(cè)。各檢測(cè)脈沖信號(hào)擴(kuò)增并利用AD轉(zhuǎn)換電路64數(shù)字化，利用微型計(jì)算機(jī)69判斷多個(gè)檢測(cè)信號(hào)是否滿足預(yù)先設(shè)定的分離條件，在滿足的情況下，在一定延遲時(shí)間后，將觸發(fā)信號(hào)輸出到電磁閥驅(qū)動(dòng)66。使該延遲時(shí)間與細(xì)胞從激光照射區(qū)域流到分選流道4-1、4-2的區(qū)域?yàn)橹沟臅r(shí)間相同。收到觸發(fā)信號(hào)的電磁閥驅(qū)動(dòng)66，向電磁閥7-1、7_2輸出僅開啟一定時(shí)間的信號(hào)。將流道4-1和4-2的區(qū)域設(shè)為相等的W，將細(xì)胞流經(jīng)流道27的流速設(shè)為V，則閥為開啟狀態(tài)的時(shí)間長(zhǎng)短優(yōu)選設(shè)定為W/V(秒)。電磁閥開啟時(shí)，目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)入分選貯液室5-1。主流道與分選流道之間的液流，在閥7-1與閥7-2為關(guān)閉狀態(tài)下不發(fā)生，因此一旦進(jìn)入分選貯液室5-1中的目標(biāo)細(xì)胞在該處被穩(wěn)定保存。此外，如圖4所示的流動(dòng)室，由于其下游側(cè)形成有分離流道11、23、24，目標(biāo)細(xì)胞根據(jù)由分選流道4-1和4-2導(dǎo)致的壓力，移動(dòng)量不足以進(jìn)入分選貯液室5-1的情況下，在下游側(cè)向流道23中分離。因此，如圖4所示的流動(dòng)室的結(jié)構(gòu)為，在流道27的流速快的情況下，向流道23分離，在流速慢的情況下，對(duì)于分離到分選貯液室5-1中的流速，實(shí)現(xiàn)兩階段邊際寬的分離。
[0161]2)作為解決一次性芯片應(yīng)對(duì)多個(gè)待測(cè)樣品方面的側(cè)方散射檢測(cè)問題的方法的本發(fā)明的細(xì)胞分離方法及裝置
[0162]下面，使用圖6和圖7，對(duì)使用一次性芯片型多流道流動(dòng)室的流式細(xì)胞儀的實(shí)施例進(jìn)行說明。為了在無污染及殘留為零的條件下檢測(cè)多個(gè)待測(cè)樣品，如圖6所示，在一個(gè)芯片上形成8條樣品流道，分別連接樣品液貯液室31。為了避免在貯液室30中混合而分隔成的8個(gè)小室37為鞘液IC液室。在各小室內(nèi)設(shè)置樣品液IC液室。各小室具有兩個(gè)鞘液IC液室與鞘液流道連接的端口。鞘液流和樣品液流，其通過按照順序?qū)Ω餍∈沂┘託鈮海瑏砜刂七B接到各個(gè)小室的樣品液與鞘液的液流，通過僅對(duì)進(jìn)行測(cè)定的樣品液流入的小室施加壓力，從而消除因樣品液或鞘液的不必要的液流而產(chǎn)生的消耗。流道截面的大小與圖4的流道截面大小相同。測(cè)量時(shí)的壓力設(shè)定為從1kPa至20kPa之間的值，除了測(cè)量時(shí)以外的壓力，設(shè)定為與下游部相同的大氣壓。在各個(gè)小室的內(nèi)部共通的氣壓施加到鞘液與樣品液上，向下游側(cè)擠出。鞘液由鞘液端口 32與基板內(nèi)流道連接，與樣品液從左右合流而流到下游側(cè)。圖7表示該芯片的截面圖與測(cè)定光學(xué)系統(tǒng)。測(cè)定光學(xué)系統(tǒng)中利用透鏡51的檢測(cè)光學(xué)系統(tǒng)幾乎與圖5相同，但增加了對(duì)流道進(jìn)行圖像觀察的光學(xué)系統(tǒng)。其為1%反射鏡、成像用透鏡81和相機(jī)82。包含激光的照射光學(xué)系統(tǒng)與檢測(cè)光學(xué)系統(tǒng)為固定狀態(tài)，采取移動(dòng)搭載了芯片的自動(dòng)載置臺(tái)來對(duì)8條流道進(jìn)行測(cè)定的方式。在8條流道的芯片中，由于是通過射出成型制備的，因此從制備上流道間的限制來看，將8條份的移動(dòng)距離設(shè)為5mm。載置臺(tái)的移動(dòng)，通過圖像識(shí)別將激光的照射位置調(diào)節(jié)到第一端的Nol流道上。然后，用一定壓力對(duì)與Nol流道連接的上游貯液室加壓，僅使樣品液在Nol流道中流動(dòng)，開始檢測(cè)。Nol流道的檢測(cè)結(jié)束后，向連接于Nol上的上游貯液室的加壓設(shè)為0，使其為大氣壓。然后移動(dòng)載置臺(tái)，使激光照射位置調(diào)節(jié)到No2流道上，對(duì)連接在No2流道上的貯液室加壓，開始檢測(cè)。直至NoS流道依次重復(fù)上述操作。測(cè)定中的側(cè)方散射光，將平面基板的端面在約為45度的斜面上向下反射，入射到設(shè)置于下側(cè)的由透明樹脂形成的導(dǎo)光塊45上，經(jīng)由連接在導(dǎo)光塊上的光纖，利用帶通濾波器43，用光檢測(cè)器44僅檢測(cè)與照射激光相同波長(zhǎng)的光。在兩端的導(dǎo)光塊集光后檢測(cè)得到的側(cè)方散射信號(hào)，進(jìn)行求和檢測(cè)。圖7表示兩端的測(cè)定散射光用兩個(gè)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，變?yōu)樾盘?hào)后檢測(cè)總和的方法。與此相對(duì)，也可以使連接在兩端導(dǎo)光塊上的光纖接合到一個(gè)檢測(cè)器上進(jìn)行檢測(cè)。導(dǎo)光塊45的寬度，由于在8條流道的芯片中，需要比8條份的移動(dòng)距離大，因此設(shè)定為10mm。如上所述，實(shí)現(xiàn)了以下裝置，在一次性芯片型的8流道芯片中，用一個(gè)芯片連續(xù)檢測(cè)8個(gè)待測(cè)樣品的前方散射、側(cè)方散射和多個(gè)熒光信號(hào)檢測(cè)。
[0163]如圖6所示，在一個(gè)透明的平面基板上形成有多個(gè)流道，連接在上游側(cè)貯液室30與下游側(cè)IC液室34上。為了避免IC液室在各流道間樣品液相混合，IC液室為每個(gè)流道隔開的結(jié)構(gòu)。圖7表示該芯片的截面圖與測(cè)定光學(xué)系統(tǒng)。測(cè)定光學(xué)系統(tǒng)中利用透鏡51的檢測(cè)光學(xué)系統(tǒng)幾乎與圖5相同，但增加了對(duì)流道進(jìn)行圖像觀察的光學(xué)系統(tǒng)。其為1%反射鏡、成像用透鏡81與相機(jī)82。在此，通過圖像識(shí)別來掌握流道與激光照射位置的關(guān)系，反饋給載置臺(tái)的移動(dòng)，從而能夠自動(dòng)調(diào)節(jié)激光位置與流道的位置。激光與檢測(cè)光學(xué)系統(tǒng)為固定狀態(tài)，在自動(dòng)載置臺(tái)上，通過步進(jìn)重復(fù)掃描依次照射芯片的各流道的中心區(qū)域。側(cè)方散射光將平面基板的端面在約為45度的斜面上向下反射，入射到設(shè)置于下側(cè)的由透明樹脂形成的導(dǎo)光塊45上，經(jīng)由連接在導(dǎo)光塊上的光纖，利用帶通濾波器43，僅透射與照射激光相同波長(zhǎng)的光，并用光檢測(cè)器44檢測(cè)。
[0164]圖8a)表示多個(gè)流道中，激光照射左端的流道中心的情況下，芯片與兩端導(dǎo)光塊間的位置關(guān)系。圖8b)表示多個(gè)流道中，激光照射右端的流道中心的情況下，芯片與兩端導(dǎo)光塊間的位置關(guān)系。將導(dǎo)光塊的掃描方向的寬度設(shè)為比掃描范圍的距離大的值，以使在任何情況下，在兩端反射的側(cè)方散射光均入射到導(dǎo)光塊上。進(jìn)一步地，將在兩端導(dǎo)光塊上集光檢測(cè)到的側(cè)方散射信號(hào)進(jìn)行加法運(yùn)算，從而降低檢測(cè)到的側(cè)方散射光的檢測(cè)靈敏度對(duì)各流道的依賴性。作為求和的方法，也可以將連接于兩端導(dǎo)光塊上的光纖直接接合到一個(gè)檢測(cè)器上。
[0165]3)作為準(zhǔn)確檢測(cè)測(cè)定樣品液中所包含的粒子濃度的方法的本發(fā)明的細(xì)胞分離方法及裝置
[0166]下面，使用圖6與圖9，對(duì)準(zhǔn)確檢測(cè)溶液中粒子濃度的方法的實(shí)施例進(jìn)行說明。為了準(zhǔn)確測(cè)定濃度，對(duì)投入到樣品液貯液室中的樣品液量全部進(jìn)行檢測(cè)，用計(jì)數(shù)的細(xì)胞除以液量。因此，采取以下方法，在包含氣泡的狀態(tài)下測(cè)定樣品液的總量，測(cè)定后將氣泡從數(shù)據(jù)中去除，從而準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)胞濃度。圖6中的樣品液貯液室31的容量為100 μ L。因此，將包含細(xì)胞的50 μ L樣品液加入樣品液貯液室31中，測(cè)定時(shí)間設(shè)為6分鐘，流量設(shè)為10 μ L/min。于是，約5分鐘時(shí)樣品液消失，約I分鐘為包含氣泡的檢測(cè)。圖9a)為測(cè)定被稱為MCF-7的來自乳癌的細(xì)胞，但由于測(cè)定了樣品液整體而含有氣泡。氣泡是在樣品液消失后，被樣品貯液室擠壓的空氣在流道內(nèi)形成的，并通過測(cè)定區(qū)域，使檢測(cè)數(shù)增大。比細(xì)胞大的分布(前方散射信號(hào)FS大)在樣品溶液消失后，產(chǎn)生圖9a)的A分布。
[0167]測(cè)定后，從測(cè)常數(shù)據(jù)中去除檢測(cè)時(shí)刻后的數(shù)據(jù)時(shí)，可知能夠在保留細(xì)胞分布或細(xì)胞以外的異物的狀態(tài)下去除A分布。這是由于A分布為在測(cè)量的后半段，來自于樣品液消失時(shí)刻之后所產(chǎn)生的氣泡的分布。進(jìn)一步地，能夠判斷與A分布一同被去除的分布為來自氣泡的分布。
[0168]在一次性芯片中，流道連接于樣品液貯液室的下側(cè)。在樣品液貯液室中加入100微升，檢測(cè)全部的該樣品液，設(shè)定粒子的計(jì)數(shù)為10000個(gè)，則應(yīng)該能夠?qū)С隽Ｗ拥臐舛葹?00000個(gè)/毫升。但是，這在現(xiàn)有方法中是不可能的。即，從樣品液消失后，馬上以高頻率產(chǎn)生表示與粒子不同分布的氣泡，該氣泡分布成為對(duì)粒子計(jì)數(shù)的障礙。在通常的流式細(xì)胞儀中，由于一般是從上方在樣品液容器中吸出樣品液的方式，因此不進(jìn)行樣品液總量的檢測(cè)，也不能進(jìn)行。因此，為了用一次性芯片來準(zhǔn)確檢測(cè)濃度，下面對(duì)不受氣泡影響的檢測(cè)樣品液總量的方法進(jìn)行敘述。由于氣泡是在樣品液消失之后產(chǎn)生，因此將檢測(cè)時(shí)間從最后數(shù)據(jù)起按時(shí)間回溯，從檢測(cè)到的數(shù)據(jù)中去除，從而能夠獲得去除了氣泡分布的僅為粒子的數(shù)據(jù)。用作為本發(fā)明人的發(fā)明的專利文獻(xiàn)14中記載的芯片檢測(cè)全部樣品液而獲得的，包含氣泡分布的數(shù)據(jù)如圖9a)所示。橫軸為前方散射，縱軸為熒光信號(hào)強(qiáng)度。圖9b)為從全部數(shù)據(jù)中去除后部分檢測(cè)時(shí)間的數(shù)據(jù)。可知前方散射光強(qiáng)度大的分布已被去除。關(guān)注來自該氣泡的分布中的一個(gè)分布，若從檢測(cè)的最后開始去除數(shù)據(jù)，直至該分布消失為止，則能夠去除氣泡。由此，能夠測(cè)定全部樣品液，能夠求出準(zhǔn)確的粒子濃度。
[0169]4)流式細(xì)胞儀的多維數(shù)據(jù)分析方法及其顯示方法和裝置。
[0170]圖10(A)表不兩種焚光檢測(cè)信號(hào)FL1、FL2的波長(zhǎng)區(qū)域與兩種焚光分子A、B的光譜。在將細(xì)胞用A和B兩種熒光分子進(jìn)行熒光染色的情況下，對(duì)利用FLl和FL2的熒光信號(hào)求出細(xì)胞內(nèi)的A分子與B分子的豐度的方法進(jìn)行說明。熒光檢測(cè)信號(hào)FLl與FL2之間，存在由熒光光譜的形狀規(guī)定的關(guān)系。其為比例一定的關(guān)系。例如，熒光光譜A的FLl的檢測(cè)波長(zhǎng)區(qū)域的面積設(shè)為Al，F(xiàn)L2的檢測(cè)波長(zhǎng)區(qū)域的面積設(shè)為A2，則FLl與FL2的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度比為A1/A2。即，用數(shù)學(xué)式表達(dá)如下。
[0171]FL1/FL2 = A1/A2 (I)
[0172]若變形為對(duì)數(shù)圖表，則為
[0173]LogFLl = LogFL2+Log (A1/A2) (2)
[0174]同樣地，熒光光譜B的情況下的FL1/FL2，其信號(hào)強(qiáng)度比為B1/B2。即，
[0175]FL1/FL2 = B1/B2 (3)
[0176]若變形為對(duì)數(shù)圖表，則為
[0177]LogFLl = LogFL2+Log (B1/B2) (4)
[0178]因此，在檢測(cè)用熒光分子A進(jìn)行了熒光染色的細(xì)胞的情況下，F(xiàn)Ll與FL2的對(duì)數(shù)軸的散布圖，為如圖10⑶中黑圈所示的線性分布。同樣地，在用熒光分子B進(jìn)行了熒光染色的細(xì)胞的情況下，為白圈所示的線性分布。這樣一來，在散布圖中，熒光光譜不同的粒子，其縱軸的截距值分布于不同的直線上。下面，考慮熒光分子A與熒光分子B兩者均存在的情況。將各自的數(shù)分別設(shè)為X和1，則信號(hào)強(qiáng)度FLl與FL2如下式5和式6所示。
[0179]FLl = Alx+Bly (5)
[0180]FL2 = A2x+B2y (6)
[0181]根據(jù)式5和式6得出下式。
[0182]LogFLl = LogFL2+Log[(Alx+Bly)/(A2x+B2y)] (7)
[0183]如圖1l(A)所示，該式表示存在于式2與式4所示的兩條直線間的直線，根據(jù)X和I的比例，其位置會(huì)改變。
[0184]取式5與式6的比，進(jìn)行變形，則從FL1/FL2求出x/y，得到下式。
[0185]x/y = [(B1/B2)-(FL1/FL2)]/[(FL1/FL2)- (A1/A2)] (B2/A2) (8)
[0186]式8的右邊第一項(xiàng)，B1/B2為用100% B進(jìn)行染色的樣品數(shù)據(jù)求得的常數(shù)，A1/A2為用100% A進(jìn)行染色的樣品數(shù)據(jù)求得的常數(shù)，F(xiàn)L1/FL2為樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)。第2項(xiàng)，是以相同分子數(shù)