一種喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-親和基質(zhì)的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物化學(xué)及層析領(lǐng)域，更具體涉及一種喹噁啉-2-甲醛-1,4-二 氧-親和基質(zhì)的制備方法，同時(shí)還涉及一種喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧-親和基質(zhì)的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 親和層析技術(shù)（Affinity Chromatography, AC)是一種液相色譜方法，是利用生 物大分子與親和色譜固定化配體之間存在的特異性吸附作用力，來(lái)進(jìn)行選擇性分離生物 大分子的方法（于世林，2008;Leslie et al.，2008)，是篩選配體結(jié)合蛋白的經(jīng)典技術(shù) (Hage, 1999)。親和層析技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)在于它能夠從粗提液中經(jīng)過(guò)一次簡(jiǎn)單的處理便可 得到所需高純度的活性物質(zhì)（陳勇等，2001)。將藥物分子固定到固相載體（如微珠）上， 與細(xì)胞蛋白質(zhì)裂解液充分混合孵育，然后洗脫去除沒(méi)有結(jié)合的蛋白質(zhì)，再通過(guò)高離子強(qiáng)度 洗脫或是煮沸處理等方法將靶標(biāo)蛋白與固相載體上的藥物配體分離，這樣上清液中的蛋 白質(zhì)即為藥物結(jié)合蛋白（周婦婦等，2011;〇3111：代03838 6七31.，1971)。因此，藥物小分 子能否偶聯(lián)到固相載體（即親和基質(zhì)）上形成固定化的配體是決定親和色譜成功與否的 關(guān)鍵（Cautrecasas，1999)。運(yùn)用親和層析技術(shù)已成功鑒定出多種內(nèi)源及外源性物質(zhì)的結(jié) 合蛋白，如對(duì)植物生長(zhǎng)與發(fā)育至關(guān)重要的脫落酸（Abscisic acid，ABA)的結(jié)合蛋白（Shen et al.，2006 ;Zhang et al.，2002)。高效的親和層析方法不僅在藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合 (Joseph et al. ,2010)、藥物革巴標(biāo)的高通量篩選（Vuignier et al. ,2013)中具有廣泛應(yīng) 用，在蛋白復(fù)合物的分離及蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)方面同樣扮演著重要角色（Azarkan et al. , 2007 ；Fukao, 2012)〇
[0003] 配體的固定化過(guò)程是運(yùn)用親和層析方法篩選藥物結(jié)合蛋白的關(guān)鍵步驟 (Cautrecasas et al.,1971)，選擇合適的親和基質(zhì)對(duì)于我們分離與鑒定生物活性化合物 的靶蛋白至關(guān)重要。常用的親和基質(zhì)主要有瓊脂糖凝膠，但是瓊脂糖等固相載體容易親和 非特異性結(jié)合蛋白，不能有效分離與生物活性化合物特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，使得靶蛋白鑒 定更加復(fù)雜（Kuramochi et al.，2008 ;Shimizu et al.，2000 ;Yamamoto et al.，2006)。 因此在將瓊脂糖親和珠與目標(biāo)化合物進(jìn)行偶聯(lián)形成固定化配體（immobilized-ligand)的 過(guò)程中，連接臂的使用不僅能使藥物與基質(zhì)順利偶聯(lián)，提高配基的空間利用度，還可以避免 基質(zhì)對(duì)革巴蛋白的空間干擾效應(yīng)（Ziegler et al. ,2013)。脫落酸（Abscisic acid, ABA) 是一種對(duì)植物生長(zhǎng)與發(fā)育至關(guān)重要的激素，Zhang等利用EAH-Sepharose 4B基質(zhì)與ABA 進(jìn)行偶聯(lián)，通過(guò)親和層析方法成功篩選到ABA的結(jié)合蛋白（Shen et al.，2006;Zhang et al.，2002)。AffiGel是一種瓊脂糖衍生物，因其良好的親水性質(zhì)而減少非特異性結(jié)合蛋 白，使其成為應(yīng)用最廣泛的偶聯(lián)基質(zhì)（Takahashi et al.，2006)。但是因?yàn)榇蠖鄶?shù)藥物的 疏水性質(zhì)，使得高親水性和化學(xué)易碎性的AffiGel與藥物在有機(jī)試劑的條件下偶聯(lián)困難， 因此能穩(wěn)定存在于有機(jī)試劑中的聚甲基丙烯酸酯衍生物親和基質(zhì)Toyopearl成為了很好 的替代產(chǎn)品。Takahashi等改進(jìn)了 Toyopearl親和基質(zhì)使其具有如同AffiGel -樣親水 性的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)能夠穩(wěn)定存在于有機(jī)試劑中，因而降低了非特異性結(jié)合蛋白的結(jié)合幾率，同 時(shí)提高了偶聯(lián)效率（Takahashi et al.，2006)。同時(shí)，一些高效能的親和珠，如FG-beads， SG-beads，也用來(lái)改變配體偶聯(lián)的條件，提高配體的偶聯(lián)效率（Shimizu et al.，2000; Sakamoto et al.，2009; Ito et al.，2010)，從而篩選出目標(biāo)化合物的結(jié)合蛋白。
[0004] 喹賽多（Cyadox，CYA)作為一類(lèi)新型喹噁啉-1，4-二氧化合物，在國(guó)內(nèi)由華中農(nóng) 業(yè)大學(xué)獸藥研宄所首次合成，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)其進(jìn)行了廣泛而且深入細(xì)致的研宄。喹賽多作為 喹噁啉類(lèi)飼料添加劑，對(duì)豬、雞、魚(yú)等食品動(dòng)物具有明顯的抗菌促生長(zhǎng)作用。與同類(lèi)藥物相 比，喹賽多毒副作用小，安全性高，屬于實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)，且用藥后吸收迅速，殘留期短，具有 良好的應(yīng)用前景。將喹賽多以飼料添加劑的形式添加于仔豬日糧當(dāng)中，能夠顯著提高仔 豬體增重，并且其肝臟組織中表皮生長(zhǎng)因子（EGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-l(IGF-l)信使 RNA(mRNA)的表達(dá)也得到顯著性提高（p < 0. 05)，因此推測(cè)喹賽多可能是通過(guò)對(duì)動(dòng)物體內(nèi) EGF和IGF-1等生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控而發(fā)揮作用（王國(guó)永，2004)。朱惠玲則從內(nèi)分泌角度， 全面系統(tǒng)的研宄了喹賽多促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)的作用機(jī)制。研宄推測(cè)喹賽多主要通過(guò)兩種機(jī)制發(fā) 揮其促生長(zhǎng)效應(yīng)：一是通過(guò)提高血液中生長(zhǎng)激素（GH)、胰島素、性激素、IGF等激素水平，同 時(shí)降低皮質(zhì)醇（C0R)與生長(zhǎng)抑素（SS)濃度，從而加速體內(nèi)同化作用，刺激骨骼肌蛋白的合 成，并抑制蛋白質(zhì)的分解；二是通過(guò)提高EGF、IGF-1、胰島素及胃泌素（Gas)水平，改善胃腸 道黏膜的結(jié)構(gòu)與功能，從而促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用（朱惠玲，2007)。丁明星研宄也發(fā) 現(xiàn)喹賽多可以增加小腸絨毛膜表面積，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收（丁明星，2005)。戴夢(mèng)紅等應(yīng) 用mRNA差異顯示技術(shù)篩選出在喹賽多作用下，豬肝臟組織中差異表達(dá)的8條基因，包括鋅 指蛋白（Zinc Finger CCHC3)、抗細(xì)胞衰亡因子1(DAD1)、補(bǔ)體C3(C3)、EGF和IGF-1等5條 與喹賽多作用正相關(guān)的基因，兩條表達(dá)量上調(diào)但隨著喹賽多劑量增加表達(dá)量不變的差異基 因，分別是轉(zhuǎn)酮醇酶（TK)、ADP核糖聚合酶（PARP-1)，還有一條表達(dá)量與喹賽多劑量呈負(fù)相 關(guān)的新基因（戴夢(mèng)紅等，2009)。在此基礎(chǔ)上，邢丹與郭菊就喹賽多作用下差異表達(dá)的8條 基因信號(hào)通路與表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了研宄，發(fā)現(xiàn)多條信號(hào)通路參與喹賽多對(duì)差異基因的表達(dá)調(diào) 控，其中磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K)與核轉(zhuǎn)錄因子-kB(NF-kB)信號(hào)通路是主要的調(diào)控 通路，發(fā)揮喹賽多的藥理作用（郭菊，2012;邢丹，2012)。與此同時(shí)，利用雙向電泳與生物 質(zhì)譜技術(shù)篩選并鑒定了喹賽多在L-02細(xì)胞與豬原代肝細(xì)胞中相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，結(jié)果顯 示這些差異蛋白主要參與三羧酸循環(huán)等與能量代謝相關(guān)的過(guò)程，從而發(fā)揮喹賽多藥理作用 (劉亞輝，2012)。雖然喹賽多促生長(zhǎng)作用機(jī)理得到了較為細(xì)致的詮釋?zhuān)瞧湓诩?xì)胞內(nèi)作用 靶標(biāo)一直未能確定。有文獻(xiàn)報(bào)道，藥物的作用靶標(biāo)主要為蛋白質(zhì)（邱宗蔭等，2008)。黨永 輝利用放射性同位素氚標(biāo)記喹賽多，通過(guò)在體與離體實(shí)驗(yàn)篩選其在豬肝臟組織中的結(jié)合蛋 白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氚標(biāo)喹賽多在細(xì)胞核蛋白裂解液中隨著孵育濃度的升高而趨于飽和，但是并 沒(méi)有成功篩選到能與喹賽多特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)（黨永輝，2012)。喹賽多作用細(xì)胞之后， 是否有特異性結(jié)合蛋白與之相互作用，打通下游信號(hào)通路，從而發(fā)揮其促生長(zhǎng)的藥理作用， 對(duì)我們研宄喹賽多的促生長(zhǎng)機(jī)理具有重要意義。雖然喹賽多的促生長(zhǎng)作用已在基因水平、 蛋白水平以及整體動(dòng)物的水平得以闡釋?zhuān)青惗嗉ぐl(fā)這些效應(yīng)的基礎(chǔ)是什么還不甚明 了。而藥物與細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜靶標(biāo)之間的相互作用，是藥物發(fā)揮作用的基礎(chǔ)（周婷婷等， 2011)〇
[0005] 肝臟是藥物代謝的主要器官，胥寧研宄喹賽多在動(dòng)物體內(nèi)的分布與消除規(guī)律發(fā) 現(xiàn)，在豬肝臟與腎臟中藥物消除最慢（胥寧，2012)。通過(guò)前期在體與離體試驗(yàn)研宄發(fā)現(xiàn)，喹 賽多能夠上調(diào)EGF、IGF-lmRNA的表達(dá)（黨永輝，2012 ;王國(guó)永，2004)。L-02細(xì)胞系是從成 人正常肝臟分