離培養(yǎng)而來，具有肝臟特異性功能，能穩(wěn)定傳代，且不會像腫瘤細胞一樣惡性 增殖（Chen et al.，2012)，因此成為很好的肝細胞研宄模型。
[0006] 聚甲基丙稀酸醋衍生物親和基質(zhì)Toyopearl不同于瓊脂糖衍生物等親和基質(zhì)，能 夠在有機試劑中穩(wěn)定存在。Teruki等改進了 Toyopearl親和基質(zhì)，使其具有如同瓊脂糖一 樣良好的親水性，同時能夠穩(wěn)定存在于有機試劑中，因而降低了非特異性結合蛋白的結合 幾率，同時提高了偶聯(lián)效率（Takahashi et al.，2006)。因此我們在實驗中選用富含氨基的 Toyopearl AF-Amin〇-650M親和基質(zhì)，與改造化合物進行偶聯(lián)，得到固定化配體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧-親和基質(zhì)的制備方 法，以具有良好親水性的ToyopearlAF-Amin〇-650M樹脂為固體支持物，偶聯(lián)藥物小分子配 體后形成穩(wěn)定的親和層析基質(zhì)，降低了非特異性結合蛋白的結合幾率，同時提高了偶聯(lián)效 率。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧-親和基質(zhì)的 應用，在適合的緩沖液條件下能夠捕獲細胞蛋白裂解液中與喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧特 異性結合的蛋白質(zhì)，同時還可以用來篩選具備喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧結構的藥物或化 合物的特異性結合蛋白。
[0009] 為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術措施：
[0010] 一種喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧-親和基質(zhì)的制備方法，其步驟是：
[0011] A、喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧的制備：
[0012] 以苯并呋咱為原料，以1:2的質(zhì)量體積比加入丙酮中充分溶解，向其中緩慢滴加 5~6滴四氫吡略，保持55~60°C反應，反應完成后，收集黃色固體即甲基喹噁啉。將體積 比為9 : 1的二甲基亞砜：無水乙醇加入反應釜中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速1300rpm，待溫度升高為80°C 后，向反應釜中投入2倍質(zhì)量的二氧化硒與甲基喹噁啉進行反應。反應完畢后，收集黃色針 狀固體即為喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧。
[0013] B、喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧與基質(zhì)的偶聯(lián)：
[0014] 取200 y L用DMF預處理過的親和樹脂基質(zhì)，與步驟A中合成的充分溶解于DMF中 的喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧充分混合，再加入6. 4mg氰基硼氫化鈉，磁力攪拌器低速室溫 (20-25°C，以下相同）過夜。同時準備未與喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧偶聯(lián)的空白基質(zhì)對 照組。
[0015] 取出過夜偶聯(lián)的反應物，過濾或瞬時離心，上清取10 0 y L標記為"偶聯(lián)喹噁 啉-2-甲醛-1，4-二氧-親和基質(zhì)后上清液"，留作HPLC分析，沉淀基質(zhì)用DMF洗1~2次。
[0016] 將實驗組與空白組基質(zhì)分別用1~2mL醋酸酐（含20% DMF)室溫混合30~ 60min，然后用DMF和20% (體積比，以下相同）酒精洗1~2次。將獲得的喹噁啉-2-甲 醛-1，4-二氧-親和基質(zhì)保存在20 %酒精溶液中，備用。
[0017] C、高效液相色譜分析偶聯(lián)效率：
[0018] 標記的待檢樣品有"溶劑DMF空白對照"、"喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧"、"偶聯(lián)喹 噁啉-2-甲醛-1，4-二氧-親和基質(zhì)后上清液"，將待檢樣品用流動相稀釋2000倍，利用 HPLC檢測溶液中化合物的出峰時間與峰面積，從而計算化合物喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧 與親和基質(zhì)的偶聯(lián)效率，檢測條件如下，結果見圖1。
[0019]色譜條件：Zorbaxeclipse XDB-C18(150mmX2. lmm，3. 5ym)，紫外檢測波長 372nm，柱溫30°C，流速為lmL/min，進樣量50 y L，每個樣品檢測時間為lOmin。流動相體積 比為35 : 50 : 15的去離子水：甲醇（色譜級）：乙腈（色譜級），等度洗脫。
[0020] 一種喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧-親和基質(zhì)的應用，其步驟是：
[0021] A、喹嚼啉-2-甲醛-1，4-二氧-親和基質(zhì)對蛋白質(zhì)的連續(xù)親和層析實驗：
[0022] 取100 y L喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧-親和基質(zhì)（實驗組）、25 y L未偶聯(lián)喹噁 啉-2-甲醛-1，4-二氧的樹脂基質(zhì)（空白基質(zhì)對照組）分別與lmL裂解buffer 4°C混合至 少 40min。
[0023] 將實驗組均分成4X 25 y L，1200rpm、4°C離心lmin，吸棄上清buffer。取25 y L空 白基質(zhì)對照組分別與lmL細胞核蛋白，4°C輕輕混勻孵育40miru4°C、12000rpm離心lmin，沉 淀A 4°C保存，留作SDS-PAGE分析。上清與另一份25 y L喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧-親 和基質(zhì)4°C輕輕混勻孵育40min。重復以上步驟4次，得到沉淀B、C、D、E。
[0024] 沉淀A、B、C、D、E均用lmL裂解buffer輕洗1次，1200rpm、4°C離心lmin。在各沉淀 基質(zhì)中加入 NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) 7.5 y L、NuPAGEReducing Agent (10X) 3 yL、 裂解液19. 5 y L，70°C煮沸l(wèi)Omin，4°C冷卻5min，離心，取上清20 y L點樣跑SDS-PAGE，以分 離蛋白質(zhì)。
[0025] 將跑好的PAGE膠用考馬斯亮藍R-250染液染色過夜，用去離子水脫色至凝膠透 明，然后用掃描儀掃描拍攝凝膠。
[0026] B、蛋白質(zhì)譜鑒定：
[0027] 用剪刀將200 yL槍頭尖端剪掉約1~2cm，孔的直徑約為2~3mm，用修剪后的吸 頭從凝膠上戳取蛋白質(zhì)點，再轉(zhuǎn)入200 yL離心管中（離心管滅菌后浸泡于75%乙醇中，用 時取出自然干燥）。
[0028]每管加入100 y L脫色液（50%乙腈，25mM碳酸氫銨），室溫放置30min，吸棄脫色 液，重復以上步驟脫色至膠塊無色透明。加入60 y L乙腈使凝膠脫水lOmin，吸棄上清液。 每塊凝膠加入約8 y L(濃度為12. 5ng/ y L)溶于100mM碳酸氫銨的胰蛋白酶，4°C吸脹lh， 吸出多余酶液，倒置于37°C溫箱中保溫12h。加入10 y L 5%三氟乙酸，lh后將溶液轉(zhuǎn)移到 新的Ep管內(nèi)，重復2次將溶液合并。加入10 yL 2. 5%三氟乙酸/50%乙腈，lh后將溶液 與之前溶液合并，重復2次。將肽段溶液在凍干機中真空低溫凍干，以備用于質(zhì)譜鑒定。用 0. 2%三氟乙酸充分溶解肽段，立即進行質(zhì)譜鑒定。
[0029] 將凍干肽混合物中加入2yL 0.2%三氟乙酸溶液，充分溶解肽段。取每個樣品 0? 6 y L手工點于MALDI靶板上，避光干燥。再取0? 6 y L飽和基質(zhì)a -氰基-4-羥肉桂酸 (CHCA)溶液（5mg/mL，溶劑為0. 1% TFA、50% ACN)手工點于MALDI靶板上，避光干燥。待 溶劑揮發(fā)后，將MALDI靶置入MALDI-T0F-T0F質(zhì)譜儀（4800Proteomies Analyzer)。樣品用 4800串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀4800Proteomies Analyzer進行質(zhì)譜分析，采用反射模式，一級、 二級質(zhì)譜連續(xù)自動檢測，采用自動獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)。肽指紋圖譜（PMF)質(zhì)量掃描 范圍為800~4000Da，且一級質(zhì)譜強度最大的5個峰進行串級質(zhì)譜分析。譜圖用myoglobin 酶解肽段進行外標校正。
[0030] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果：
[0031] 利用HPLC檢測偶聯(lián)前后溶液中化合物的含量，反向計算出偶聯(lián)效率，偶聯(lián)效率達 到了 76.84%。該方法簡便快捷，同時避免了使用刺激性氣味極強且易揮發(fā)的吡啶，減少了 對人體的傷害，安全性更高。
[0032]