本發(fā)明涉及DNA合成，尤其涉及一種用于DNA原位合成的電化學(xué)芯片，以及一種電化學(xué)芯片DNA原位合成方法。

背景技術(shù)：

基因芯片(gene chip,DNA chip,DNA microarray)又被稱為DNA芯片、DNA微陣列或生物芯片，是指以大量人工合成的或應(yīng)用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)獲得的核酸片段作為探針，按照特定的排列方式和特定的手段固定在硅片、載玻片或塑料片上，一個(gè)指甲蓋大小的芯片上排列的探針可以多達(dá)上萬(wàn)個(gè)。在使用時(shí)，先將所研究的樣品標(biāo)記，然后與芯片上的寡聚核苷酸探針雜交，再用激光共聚焦顯微鏡等設(shè)備對(duì)芯片進(jìn)行掃描，配合計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱，從而高效且大規(guī)模地獲得相關(guān)的生物信息。此項(xiàng)技術(shù)將大量的核酸分子同時(shí)固定在載體上，一次可檢測(cè)分析大量的DNA和RNA，解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、檢測(cè)目標(biāo)分子數(shù)量少、成本高、效率低等的缺點(diǎn)。

另外，通過(guò)設(shè)計(jì)不同的探針陣列(array)，利用雜交譜重建DNA序列，還可實(shí)現(xiàn)雜交測(cè)序(sequencing by hybridization,SBH)。目前，該技術(shù)在基因表達(dá)研究、基因組研究、序列分析及基因診斷等領(lǐng)域已顯示出重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

隨著基因芯片技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，出現(xiàn)多種芯片技術(shù)。最初的芯片主要目標(biāo)是用于DNA序列的測(cè)定、基因表達(dá)圖譜鑒定及基因突變體的監(jiān)測(cè)和分析，因此稱為基因芯片。但目前這一技術(shù)已擴(kuò)展到非核酸領(lǐng)域，如已出現(xiàn)了蛋白質(zhì)芯片分析技術(shù)、Biacore技術(shù)和絲網(wǎng)印刷技術(shù)等。在這一發(fā)展趨勢(shì)下，芯片技術(shù)現(xiàn)多被稱為生物芯片技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)是分子生物學(xué)中常用分子雜交技術(shù)的擴(kuò)展。其基本做法是將大量的核酸片段有規(guī)則地固定在某種介質(zhì)上，制成芯片，然后將要檢測(cè)的樣品加以標(biāo)記，再與做成的芯片充分雜交，加以洗脫，用圖像顯示出來(lái)。目前適用于制作芯片的載體材料主要有半導(dǎo)體硅片、玻璃片、金屬片、各種有機(jī)高分子制作的薄膜等。

基因芯片一般有兩種制作方法。一種為合成后交聯(lián)(post-synthetic attachment)，多用于大片段DNA，有時(shí)也適合于寡核苷酸甚至mRNA；另一種為原位合成(in-situ synthesis)，適合于寡核苷酸。其中，常見(jiàn)的原位合成方法有光導(dǎo)原位合成法、電壓打印法、流體通道合成法、分子印章法和機(jī)械點(diǎn)涂法。這些方法操作成本很高，工藝較為復(fù)雜，重復(fù)性較差，并且在單位面積上探針的數(shù)量會(huì)受 到技術(shù)的限制。

本發(fā)明提供了一種電化學(xué)芯片DNA原位合成方法，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制芯片上電極的電位實(shí)現(xiàn)DNA的穩(wěn)定、準(zhǔn)確的原位合成，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)DNA的自動(dòng)原位合成。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種電化學(xué)芯片DNA原位合成方法，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制芯片上電極的電位實(shí)現(xiàn)DNA的穩(wěn)定、準(zhǔn)確的原位合成，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)DNA的自動(dòng)原位合成。

具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種用于DNA原位合成的電化學(xué)芯片，其特征在于，包括反應(yīng)區(qū)，該反應(yīng)區(qū)包括電極區(qū)與涂覆于該電極區(qū)表面的高分子聚合物，所述電極區(qū)包括至少一個(gè)鉑電極，所述高分子聚合物在所述電極的另一側(cè)具有堿基序列連接端，并且此堿基序列連接端連接有保護(hù)基團(tuán)。

本發(fā)明還提供了一種基于上述電化學(xué)芯片進(jìn)行DNA原位合成方法，包括

在所述電化學(xué)芯片的反應(yīng)區(qū)的外側(cè)表面覆蓋電解質(zhì)溶液；

將選定電極置于高電位，從而在所述電極周圍、反應(yīng)液中產(chǎn)生氫離子；

連接于所述電化學(xué)芯片表面堿基序列連接端的保護(hù)基團(tuán)在所述氫離子提供的局部酸性環(huán)境中脫去；

恢復(fù)所述電極的電位，將所述反應(yīng)區(qū)的外側(cè)表面的電解質(zhì)溶液替換為反應(yīng)液，所述反應(yīng)液呈堿性并溶解有一端連有保護(hù)基團(tuán)的堿基；

所述一端連有堿基保護(hù)基團(tuán)的堿基連接到所述堿基序列連接端；

去除所述反應(yīng)液。

進(jìn)一步地，所述電解質(zhì)溶液呈堿性。

進(jìn)一步地，恢復(fù)所述電極的電位，將所述反應(yīng)區(qū)的外側(cè)表面的電解質(zhì)溶液替換為反應(yīng)液，所述反應(yīng)液反應(yīng)液呈堿性并溶解有一端連有保護(hù)基團(tuán)的堿基包括

將所述電極的電位置于零電位；

吸取所述電解質(zhì)溶液；

使用第一緩沖液沖洗所述反應(yīng)區(qū)的外側(cè)表面；

在所述反應(yīng)區(qū)的外側(cè)表面覆蓋反應(yīng)液，其中溶解有一端連有保護(hù)基團(tuán)的堿基。

進(jìn)一步地，所述第一緩沖液為醋酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、MOPS緩沖液、磷酸鹽緩沖液、TRIS緩沖液或碘酸鉀溶液。

進(jìn)一步地，所述反應(yīng)液呈堿性。

進(jìn)一步地，所述去除所述反應(yīng)液包括

吸取所述反應(yīng)液；

使用第二緩沖液沖洗所述反應(yīng)區(qū)的外側(cè)表面。

進(jìn)一步地，所述第二緩沖液為醋酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、 HEPES緩沖液、MOPS緩沖液、磷酸鹽緩沖液、TRIS緩沖液或碘酸鉀溶液。

本發(fā)明提供的電化學(xué)DNA原位合成方法通過(guò)改變特定電極的電位，實(shí)現(xiàn)DNA的穩(wěn)定和準(zhǔn)確的原位合成；結(jié)合計(jì)算機(jī)控制和自動(dòng)控制技術(shù)，還可實(shí)現(xiàn)DNA的自動(dòng)原位合成，降低基因芯片的合成成本，精度也大為提高。

以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說(shuō)明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

附圖說(shuō)明

圖1是一種電化學(xué)芯片上鉑電極在底板上的排列示意圖；

圖2是一種電化學(xué)芯片的主要結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是電化學(xué)芯片上鉑電極和高分子聚合物在底板上的位置示意圖；

圖4示出了高分子聚合物表面的堿基序列連接端以及其上連接的保護(hù)基團(tuán)；

圖5是電化學(xué)芯片表面覆蓋有電解質(zhì)溶液時(shí)的示意圖；

圖6是將圖5中左側(cè)鉑電極置于高電位時(shí)的反應(yīng)示意圖；

圖7是將圖6中的電解質(zhì)溶液替換為反應(yīng)液時(shí)的示意圖，其中鉑電極已在低電位；

圖8是5’端保護(hù)的堿基連接到脫去保護(hù)的堿基序列連接端的反應(yīng)示意圖；

圖9是將圖8中的反應(yīng)液替換為電解質(zhì)溶液時(shí)的示意圖；

圖10是繼續(xù)將圖5中左側(cè)鉑電極置于高電位時(shí)的反應(yīng)示意圖；

圖11是將圖10中的電解質(zhì)溶液替換為反應(yīng)液時(shí)的示意圖，其中鉑電極已在低電位；

圖12是5’端保護(hù)的堿基連接到事先已經(jīng)連接于堿基序列連接端、并已脫去保護(hù)的堿基的反應(yīng)示意圖；

圖13是將圖12中的反應(yīng)液替換為電解質(zhì)溶液時(shí)的示意圖；

圖14是將圖5中右側(cè)鉑電極置于高電位時(shí)的反應(yīng)示意圖；

圖15是將圖14中的電解質(zhì)溶液替換為反應(yīng)液時(shí)的示意圖，其中鉑電極已在低電位；

圖16是5’端保護(hù)的堿基連接到脫去保護(hù)的堿基序列連接端的反應(yīng)示意圖；

圖17是去除圖16中反應(yīng)液并用緩沖液沖洗電化學(xué)芯片表面的示意圖，其中鉑電極已在低電位；

圖1-圖17中，1-基板，2-鉑電極，3-高分子聚合物，4-堿基序列連接端，5-保護(hù)基團(tuán)，6-電解質(zhì)溶液，7-5’端保護(hù)的堿基，8-反應(yīng)液，9-脫去保護(hù)的堿基。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至 終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

在本發(fā)明的描述中，需要理解的是，術(shù)語(yǔ)“中心”、“縱向”、“橫向”、“長(zhǎng)度”、“寬度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底”“內(nèi)”、“外”、“順時(shí)針”、“逆時(shí)針”等指示的方位或位置關(guān)系為基于附圖所示的方位或位置關(guān)系，僅是為了便于描述本發(fā)明和簡(jiǎn)化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構(gòu)造和操作，因此不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

此外，術(shù)語(yǔ)“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者更多個(gè)該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上，除非另有明確具體的限定。

在本發(fā)明中，除非另有明確的規(guī)定和限定，術(shù)語(yǔ)“安裝”、“相連”、“連接”、“固定”等術(shù)語(yǔ)應(yīng)做廣義理解，例如，可以是直接相連，也可以通過(guò)中間媒介間接相連。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以根據(jù)具體情況理解上述術(shù)語(yǔ)在本發(fā)明中的具體含義。

在本發(fā)明中，除非另有明確的規(guī)定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接觸，也可以包括第一和第二特征不是直接接觸而是通過(guò)它們之間的另外的特征接觸。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或僅僅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或僅僅表示第一特征水平高度小于第二特征。

圖1是一種電化學(xué)芯片的基板1的結(jié)構(gòu)示意圖，其上設(shè)置有鉑電極2的陣列。如圖2所示，在基板1及鉑電極2的表面涂覆有高分子聚合物3，厚度為10-30μm。DNA原位合成即是在高分子聚合物3圖示位置的上表面進(jìn)行。

圖3示出了基板1、鉑電極2及高分子聚合物3的相對(duì)位置關(guān)系。

需要說(shuō)明的是，在高分子聚合物3表層具有特殊結(jié)構(gòu)，即其表面具有堿基序列連接端4，堿基序列連接端4連接有保護(hù)基團(tuán)5。其結(jié)構(gòu)已經(jīng)在圖4中示出。相鄰鉑電極2的中心之間的距離為300μm。雖然相鄰鉑電極2之間也具有相同結(jié)構(gòu)，但是因?yàn)樵缓铣傻倪^(guò)程中并不涉及，故已省略。

如圖5，在高分子聚合物3表面覆蓋一層電解質(zhì)溶液6(NaCO₃溶液，其濃度為0.05mol/L)，覆蓋過(guò)程為將電解質(zhì)溶液6充入高分子聚合物3表面設(shè)置的反應(yīng)室(未示出)。后續(xù)各步驟的溶液覆蓋和沖洗均通過(guò)在這樣的反應(yīng)室內(nèi)充入溶液進(jìn)行，不 再贅述。電解質(zhì)溶液6呈現(xiàn)堿性，其pH約為9。保護(hù)基團(tuán)5在堿性環(huán)境中并不會(huì)脫去，但是在酸性環(huán)境中會(huì)脫去。

為便于說(shuō)明，本實(shí)施例以兩個(gè)相鄰的鉑電極為例說(shuō)明，但是這并不暗示參與反應(yīng)的鉑電極之間有任何位置關(guān)系的要求；事實(shí)上，實(shí)際操作過(guò)程中，本例所述的反應(yīng)過(guò)程可以發(fā)生在任一設(shè)置于基板上的鉑電極位置。

如圖6所示，給左側(cè)的鉑電極2通電，提高其電位至+5V，在其對(duì)應(yīng)位置的電解質(zhì)溶液中會(huì)局部聚集H+離子，從而形成酸性微環(huán)境，使對(duì)應(yīng)位置堿基序列連接端4所連接的保護(hù)基團(tuán)5脫去，而右側(cè)鉑電極2附近的堿基序列連接端不受影響。通電過(guò)程持續(xù)約8s?；謴?fù)所有通電鉑電極2的電位。

用HEPES緩沖溶液沖洗高分子聚合物3的表面，再如圖7所示在高分子聚合物3表面覆蓋溶解有5’端保護(hù)的堿基7的反應(yīng)液8。那么，5’端保護(hù)的堿基7的3’端連接到已經(jīng)脫去保護(hù)基團(tuán)5的堿基序列連接端4，而沒(méi)有脫去保護(hù)基團(tuán)5的堿基序列連接端4則不能連接5’端保護(hù)的堿基7，如圖8。此處堿基可為鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶中的任一種。

如圖9，用HEPES緩沖溶液沖洗高分子聚合物3的表面三次，再覆蓋電解質(zhì)溶液6。此時(shí)，需要在左側(cè)的鉑電極2表面的高分子聚合物3已經(jīng)連接的5’端保護(hù)的堿基7末端繼續(xù)連接堿基。則，如圖10所示仍將左側(cè)鉑電極2置于+5V，與前述過(guò)程類似，小范圍聚集的H+形成的局部酸性環(huán)境使之前連接的5’端保護(hù)的堿基7所連接的保護(hù)基團(tuán)5脫去。

用HEPES緩沖溶液沖洗高分子聚合物3的表面，再如圖11所示在高分子聚合物3表面覆蓋溶解有5’端保護(hù)的堿基7的反應(yīng)液8。此處堿基可為鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶中的任一種。

如圖12，后續(xù)加入的5’端保護(hù)的堿基7連接到前述已經(jīng)脫去保護(hù)基團(tuán)并連接于堿基序列連接端4的堿基上。

使用HEPES緩沖溶液沖洗高分子聚合物3的表面三次，再覆蓋電解質(zhì)溶液6。此時(shí)需要在右側(cè)鉑電極對(duì)應(yīng)的高分子聚合物3表面連接堿基，則將右側(cè)鉑電極2置于高電位的+5V，如圖14，局部的酸性環(huán)境使堿基序列連接端4連接的保護(hù)基團(tuán)5脫去。

用HEPES緩沖溶液沖洗高分子聚合物3的表面，再如圖15所示在高分子聚合物3表面覆蓋溶解有5’端保護(hù)的堿基7的反應(yīng)液8。此處堿基可為鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶中的任一種。則此處添加的5’端保護(hù)的堿基7的3’端如圖16所示連接于堿基序列連接端4。

使用HEPES緩沖溶液沖洗高分子聚合物3的表面三次，此時(shí)在高分子聚合物3表面得到長(zhǎng)度分別為2個(gè)堿基和3個(gè)堿基的兩種堿基鏈，如圖17。堿基可為鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶中的任一種。

以上步驟描述了通過(guò)改變鉑電極2的電位從而在高分子聚合物3表面連接堿基的過(guò)程。后續(xù)需要合成結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜的用于實(shí)用目的的堿基鏈，可以重復(fù)上述類似的過(guò)程，直至得到所需的堿基鏈，可用于實(shí)驗(yàn)或診斷目的，例如制作DNA探針。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。