本發(fā)明屬于鏈球菌病免疫診斷、檢測
技術領域：
，涉及一種鏈球菌即無乳鏈球菌的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定及其試劑盒的制備方法。技術背景無乳鏈球菌（Streptococcusagalactiae）是一種具有高毒力的革蘭氏陽性菌，能感染多種淡水和海水魚類，每年給世界水產養(yǎng)殖業(yè)帶來數(shù)以億計的損失，近幾年在我國南方羅非魚養(yǎng)殖區(qū)肆虐流行，由于生產上缺乏有效的診斷檢測方法，致使羅非魚無乳鏈球菌病沒有得到有效監(jiān)控和防治，給羅非魚養(yǎng)殖造成了造成重大損失，嚴重阻礙了我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前對無乳鏈球菌病診斷檢測方法主要有：（1）常規(guī)的形態(tài)培養(yǎng)鑒定、生理生化鑒定等傳統(tǒng)方法，這些傳統(tǒng)的診斷檢測方法通常精確度較低，耗時耗力（2）分子生物學檢測方法，主要有PCR、LAMP等一些分子生物學方法，這些分子生物學方法雖然靈敏度高，但操作技術難度高，基層使用有一定的困難。（3）免疫學檢測方法，免疫學的檢測方面很多，有檢抗體的，也有檢抗原的，檢抗體的如間接酶聯(lián)免疫吸附試驗，這種方法只能檢到循環(huán)抗體，但不能區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染，因此不能對疫病做出準確的診斷。本發(fā)明利用我們制備和篩選鑒定的抗魚源無乳鏈球菌的特異的3A9和4C12單克隆抗體建立一種新的羅非魚鏈球菌病免疫診斷檢測方法，即：雙抗體夾心ELISA法的檢測方法，本發(fā)明由于利用了針對羅非魚無乳鏈球菌的特異的單克隆抗體，不僅可以直接檢測病原進行現(xiàn)癥診斷，而且由于單克隆抗體可大量的制備、質量容易控制，因此可進一步提高檢測方法的穩(wěn)定性、靈敏度和特異性。本發(fā)明為臨床上診斷和檢測羅非魚源無乳鏈球菌病提供了一種新的方法，可用于羅非魚無乳鏈球菌的檢測、診斷和藥物治療評價等。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，為臨床提供一種檢測無乳鏈球菌的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒及其制備方法，可為臨床實際提供一種用于羅非魚無乳鏈球菌的檢測、診斷和藥物治療評價的新方法。本發(fā)明所述的檢測無乳鏈球菌的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，包被有3A9單克隆抗體的多孔板，辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體4C12和顯色底物3'.3'.5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。本發(fā)明為達到上述目標，選擇了專利申請人制備、篩選的3A9單克隆抗體作為包被抗體，所述單克隆抗體由保藏號為:CCTCCNO:C2014244的雜交瘤細胞生產，C2014244雜交瘤細胞保存在中國典型培養(yǎng)物保存中心。所述試劑盒中，包被有3A9單克隆抗體的多孔板、辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體4C12和顯色底物3'.3'.5，5'-四甲基聯(lián)苯胺分別各自單獨存放。進一步的：所述多孔板每孔包被3A9單克隆抗體濃度為2.0-200.0μg/mL。進一步的：所述試劑盒還包括顯色底物3'.3'.5，5'-四甲基聯(lián)苯胺。進一步的：所述多孔板每孔包被3A9單克隆抗體的用量為100μL，濃度為10.0μg/mL。進一步的：所述辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體為4C12，所述辣根過氧化物酶標記單克隆抗體4C12的制備方法為：1）按常規(guī)方法制備小鼠腹水單克隆抗體4C12，用正辛酸一飽和硫酸銨法提純小鼠腹水單克隆抗體4C12，以BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測得單克隆抗體4C12的濃度為4.34mg/mL，單克隆抗體4C12放置于-20℃環(huán)境下保存?zhèn)溆茫?)稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于1ml蒸餾水中；3)將步驟2）獲得的溶液加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，冰浴下避光攪拌15分鐘；4)將步驟3）獲得的溶液裝入透析袋中，用1mMpH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4小時換液一次，期間換液3-5次；5)在步驟4）獲得的溶液中加入20μl0.2MpH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mgIgG，冰浴避光攪拌2小時；6)將步驟5）獲得的溶液加入0.1ml濃度為4mg/mlNaBH4液，混勻，再在4℃環(huán)境下放置2小時；7)將步驟6）獲得的溶液裝入透析袋中，用0.15MpH7.4PBS透析，4小時換液一次，期間換液3-5次；8)將步驟7）獲得的溶液在冰浴攪拌下逐滴緩慢加入等體積飽和硫酸銨，置于4℃環(huán)境下2小時；9)將步驟8）獲得的溶液放入離心管內，用離心機3000rpm離心30min，棄去上清，沉淀用半飽和硫酸銨洗1-2次，最后沉淀物溶于0.15MpH7.4的PBS中；10)將步驟9）得到的溶液裝入透析袋中，用0.15MpH7.4的PBS緩沖鹽水透析，祛除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，12000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，即酶標4C12，酶標4C12分裝后冰凍保存，用間接ELISA方法檢測，酶標4C12的效價達1：6400，最適稀釋工作濃度為1：1600。進一步的：本發(fā)明還提供了檢測無乳鏈球菌的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒制備方法，所述步驟如下：A．制備包被有3A9單克隆抗體的多孔板用碳酸鹽緩沖液制成的包被液將3A9單克隆抗體稀釋為濃度10.0μg/mL的稀釋液，所述包被液由Na2CO31.59g、NaHCO32.93g，加雙蒸水定容至1000mL制成，其在4℃條件下保存，然后將所述3A9單克隆抗體稀釋液加入多孔板的各孔內，置于4℃環(huán)境下包被12-24小時，包被時間屆滿后，將質量濃度5%的脫脂奶粉溶液加入多孔板的各孔內，并在37℃進行封閉反應，封閉反應時間至少1-1.5小時，封閉反應結束后，用洗滌緩沖液洗滌多孔板，當多孔板上的未反應物被去除后即獲得包被有3A9單克隆抗體的多孔板，其保存溫度為4℃；B.制備辣根過氧化物酶(HRP)標記的單克隆抗體4C12按常規(guī)方法：用雜交瘤細胞制備小鼠腹水單克隆抗體4C12，用正辛酸一飽和硫酸銨法提純，以BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測得單克隆抗體4C12的濃度為4.34mg/mL，單克隆抗體至-20℃保存?zhèn)溆?；C.配備顯色底物3'.3'.5，5'-四甲基聯(lián)苯胺；D．制備檢測無乳鏈球菌的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，所述辣根過氧化物酶HRP標記4C12步驟如下：步驟1）稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于1ml蒸餾水中；步驟2）在步驟1）獲得的溶液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，冰浴下避光攪拌15分鐘；步驟3）在步驟2）獲得的溶液裝入透析袋中，用1mMpH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4小時換液一次，期間換液3-5次；步驟4）在步驟3）獲得的溶液中加20μl0.2MpH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化辣根過氧化物酶的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mgIgG(經正辛酸一飽和硫酸銨粗提的4C12和經ProteinG親和層析純化的4C12)，冰浴避光攪拌2小時；步驟5）將步驟4）獲得的溶液加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混勻，再置4℃2小時；步驟6）將步驟5）獲得的溶液裝入透析袋中，用0.15MpH7.4PBS透析，4小時換液一次，期間換液3-5次；步驟7）將步驟6）獲得的溶液在冰浴攪拌下逐滴緩慢加入等體積飽和硫酸銨，置4℃2小時；步驟8）將步驟7）獲得的溶液置于離心管內，用離心機在3000rpm條件下離心30min，棄去上清，沉淀用半飽和硫酸銨洗1-2次，最后沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS中；步驟9）將步驟8獲得的溶液裝入透析袋中，用0.15MpH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，12000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，即酶標4C12，使用時，用磷酸鹽緩沖液作1：1600倍稀釋。進一步的：所述制備包被有3A9單克隆抗體的多孔板時，所述3A9單克隆抗體稀釋液的加入量為100μL/孔，所述辣根過氧化物酶(HRP)標記的單克隆抗體4C12稀釋液的加入量為100μL/孔，所述質量濃度5%的脫脂奶粉溶液的加入量為100μL/孔。進一步的：所述洗滌緩沖液由以下成分組成：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，KCl0.2g，Na2HPO412H2O3.58g，Tween-200.5mL，加雙蒸水定容至1000mL即制成洗滌緩沖液。所述辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體4C12，制備方法如下：按常規(guī)方法，用雜交瘤細胞制備小鼠腹水單克隆抗體4C12，該單克隆抗體由保藏號為：CCTCCNO:C2014248的雜交瘤細胞生產，C2014248雜交瘤細胞保存在中國典型培養(yǎng)物保存中心。所述4C12的保藏的培養(yǎng)物名稱：一種產生抗羅非魚無乳鏈球菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C12，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址：中國武漢市，武漢大學；保藏日期：2015年1月7日；保藏編號：CCTCCNO：C2014248。用正辛酸一飽和硫酸銨法提純，以BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測得單克隆抗體4C12的濃度為4.34mg/mL，單克隆抗體至-20℃保存?zhèn)溆?。HRP標記4C12步驟如下：①稱取5mg辣根過氧化物酶（HRP）溶解于1ml蒸餾水中。②于上述溶液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，冰浴下避光攪拌15分鐘。③將上述溶液裝入透析袋中，用1mMpH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4小時換液一次，期間換液3-5次；④將上述溶液加20μl0.2MpH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mgIgG(經正辛酸一飽和硫酸銨粗提的4C12和經ProteinG親和層析純化的4C12)，冰浴避光攪拌2小時。⑤將上述溶液加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混勻，再置4℃2小時。⑥將上述溶液裝入透析袋中，用0.15MpH7.4PBS透析，4小時換液一次，期間換液3-5次。。⑦將上述溶液在冰浴攪拌下逐滴緩慢加入等體積飽和硫酸銨，置4℃2小時。⑧將上述溶液放入離心管中，用離心機3000rpm離心30min，棄去上清，沉淀用半飽和硫酸銨洗1-2次，最后沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS中。⑨將上述溶液裝入透析袋中，用0.15MpH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，12000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，即酶標4C12，使用時，用磷酸鹽緩沖液作1：1600倍稀釋。上述辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體4C12相關試劑的配制：①0.1MNaIO4：稱取241mg高碘酸鈉溶于蒸餾水10ml中。②1mMpH4.4醋酸鈉緩沖液:0.2MNaAc稱取無水醋酸鈉16.4g，加雙蒸水200ml溶解，定容到1000ml。0.2MHAc量取11.55ml冰醋酸定容到1000ml。1mMpH4.4醋酸鈉緩沖液：0.2MNaAc195ml加0.2MHAc305ml充分混勻。③0.2MpH9.5碳酸鹽緩沖液:Na2CO30.32gNaHCO30.586g加蒸餾水至50ml使用工作液再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01MpH9.5的碳酸鹽緩沖液。④稀釋緩沖液:0.15MpH7.4PBS：A.0.2mol/L的NaH2PO4：稱取NaH2PO4·2H2O31.2g加蒸餾水至1000ml溶液；B.0.2mol/L的Na2HPO4：稱取Na2HPO4·12H2O71.632g加蒸餾水至1000ml溶液；0.15MpH7.4PBS由292.5ml的A液加457.5mlB液充分混合，調節(jié)pH到7.4，并定容到1000ml。⑤NaBH4溶液(4mg/ml):臨用時稱取NaBH44mg溶于1ml蒸餾水中。本發(fā)明所述試劑盒及制備方法中，3A9單克隆抗體本質上為蛋白質，能特異識別無乳鏈球菌。所述3A9的保藏的培養(yǎng)物名稱為：一種產生抗羅非魚無乳鏈球菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株3A9，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址：中國武漢市，武漢大學；保藏日期：2015年1月7日；保藏編號：CCTCCNO：C2014244。本發(fā)明所述檢測無乳鏈球菌的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，檢測標本為感染動物（如羅非魚）的血清及腦、肝、脾、腎組織浸出液，所需儀器為酶標儀，使用方法如下：在包被有3A9單克隆抗體的多孔板的孔中加入待檢樣品，37℃反應1小時后，洗滌液洗滌3次除去未反應物，加入HRP標記的單克隆抗體4C12，37℃作用1小時后洗滌除去未反應物，加入新鮮配制的3'.3'.5，5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色，室溫顯色時間為20分鐘后加入終止液2mol/LH2SO450μL/孔終止反應，用酶標儀測所述多孔板各孔的OD450值。所述3A9的保藏的培養(yǎng)物名稱為：一種產生抗羅非魚無乳鏈球菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株3A9，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址：中國武漢市，武漢大學；保藏日期：2015年1月7日；保藏編號：CCTCCNO：C2014244。所述4C12的保藏的培養(yǎng)物名稱：一種產生抗羅非魚無乳鏈球菌的單克隆抗體的雜交瘤細胞株4C12，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址：中國武漢市，武漢大學；保藏日期：2015年1月7日；保藏編號：CCTCCNO：C2014248。本發(fā)明具有以下有益效果：1.本發(fā)明使用的識別無乳鏈球菌的單克隆抗體3A9是我們從制備的多個單克隆抗體中篩選鑒定出來的，因此使本發(fā)明所述試劑盒檢測無乳鏈球菌特異性效果更好。2.使用本發(fā)明所述試劑盒進行無乳鏈球菌檢測，操作方法簡單，一個樣品的檢測只需5個小時左右。與傳統(tǒng)的形態(tài)培養(yǎng)鑒定、生理生化鑒定等傳統(tǒng)方法相比，使用本發(fā)明所述試劑盒可以進行早期診斷，而且具有更高的檢測靈敏度。3.與常用的間接ELISA相比，使用本發(fā)明所述試劑盒，能區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染，能做出是否感染無乳鏈球菌的直接判斷，還可用于臨床無乳鏈球菌病治療效果的評價。具體實施方式下面通過實施例對本發(fā)明所述檢測無乳鏈球菌（Streptococcusagalactiae）雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定（doubleantibodysandwichELISA）試劑盒及制備方法和使用方法做進一步說明。下述實施例中涉及的材料來源和制備方法如下：3A9單克隆抗體和4C12單克隆抗體分別用3A9雜交瘤細胞株（保藏編號：CCTCCNO:C2014244）和4C12雜交瘤細胞株（保藏編號：CCTCCNO:C2014248）按常規(guī)方法制備;辣根過氧化物酶（HRP）、顯色底物3'.3'.5，5'-四甲基聯(lián)苯胺、牛血清白蛋白均為Sigma公司產品；IgG為經正辛酸一飽和硫酸銨粗提的4C12其余常規(guī)試劑為國產分析純級產品；各種試液配制：包被緩沖液配制：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加雙蒸水定容至1000mL，4℃保存；封閉液配制：脫脂奶粉5.0g，加包被液定容至100mL。稀釋緩沖液配制：稱取KH2PO40.2g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O3.58g，NaCl8.0g，加三蒸水定容至1000mL，滅菌后4℃保存?zhèn)溆?。洗滌緩沖液配制：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O3.58g，Tween-200.5mL，加雙蒸水定容至1000mL。底物緩沖液配制：Na2HPO4·12H2O3.68g，檸檬酸0.93g，加三蒸水定容至100mL。3'.3'.5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）母液配制：稱取TMB（四甲基聯(lián)苯胺）200mg，加入100mL無水乙醇溶解。顯色液配制：取TMB母液500μL，底物緩沖液10mL，0.75%H2O232μL混勻。終止液配制：量取2M濃H2SO422.2mL，蒸餾水177.8mL混合（操作小心）。多孔板為市售96孔的酶標檢測用多孔板。實施例1本實施例中，采用以下工藝步驟制備檢測無乳鏈球菌雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒。（1）制備包被有3A9單克隆抗體的多孔板用碳酸鹽緩沖液即包被液將3A9單克隆抗體稀釋為濃度10.0μg/mL的稀釋液，然后將所述3A9單克隆抗體稀釋液加入多孔板的各孔內，置于4℃包被至少12小時，包被時間屆滿后，將質量濃度5%的脫脂奶粉溶液加入多孔板的各孔內，并在37℃進行封閉反應，封閉反應時間至少1小時以上，封閉反應結束后，用洗滌緩沖液洗滌多孔板，當多孔板上的未反應物被去除后即獲得包被有3A9單克隆抗體的多孔板，其保存溫度為4℃。（2）制備辣根過氧化物酶(HRP)標記的單克隆抗體4C12按常規(guī)方法：用雜交瘤細胞制備小鼠腹水單克隆抗體4C12，用正辛酸一飽和硫酸銨法提純，以BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測得單克隆抗體4C12的濃度為4.34mg/mL，單克隆抗體至-20℃保存?zhèn)溆谩RP標記4C12步驟如下：①稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于1ml蒸餾水中。②于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，冰浴下避光攪拌15分鐘。③將上述溶液裝入透析袋中，用1mMpH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4小時換液一次，期間換液3次。④加20μl0.2MpH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mgIgG(經正辛酸一飽和硫酸銨粗提的4C12和經ProteinG親和層析純化的4C12)，冰浴避光攪拌2小時。⑤加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混勻，再置4℃2小時。⑥將上述液裝入透析袋中，用0.15MpH7.4PBS透析，4小時換液一次，期間換液3次。⑦在冰浴攪拌下逐滴緩慢加入等體積飽和硫酸銨，置4℃2小時。⑧3000rpm離心30min，棄去上清。沉淀用半飽和硫酸銨洗1-2次，最后沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS中。⑨將上述溶液裝入透析袋中，用0.15MpH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，12000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，即酶標4C12，使用時，用稀釋緩沖液（同上）作1：1600倍稀釋。（3）用底物緩沖液配制3'.3'.5，5'-四甲基聯(lián)苯胺底物顯色液20000μL。所述顯色底物3'.3'.5，5'-四甲基聯(lián)苯胺為市售商品，可直接從市場購買。上述方法中，制備包被有3A9單克隆抗體的多孔板時，所述3A9單克隆抗體稀釋液的加入量為每孔100μL，所述辣根過氧化物酶(HRP)標記的單克隆抗體4C12稀釋液的加入量為100μL/孔，所述質量濃度5%的脫脂奶粉溶液的加入量為100μL/孔。本發(fā)明所述試劑盒及制備方法中，3A9單克隆抗體本質上為蛋白質，能特異識別無乳鏈球菌。本發(fā)明所述檢測無乳鏈球菌的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，檢測標本為感染動物（如羅非魚）的血清及腦、肝、脾、腎組織浸出液，所需儀器為酶標儀，使用方法如下：在包被有3A9單克隆抗體的多孔板的孔中加入待檢樣品，37℃反應1小時后，洗滌液洗滌3次除去未反應物，加入HRP標記的單克隆抗體4C12，37℃作用1小時后洗滌除去未反應物，加入新鮮配制的3'.3'.5，5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色，室溫顯色時間為20分鐘后加入終止液2mol/LH2SO450μL/孔終止反應，用酶標儀測所述多孔板各孔的OD450值。用本實施例制備的檢測無乳鏈球菌雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒對無乳鏈球菌和陰性血清進行檢測，操作如下：將無乳鏈球菌和陰性血清用稀釋緩沖液（同上）稀釋成表1中的稀釋倍數(shù)；用碳酸緩沖液（同上）將3A9單克隆抗體稀釋為濃度10.0μg/mL的稀釋液；將酶標4C12用稀釋緩沖液（同上）作1：1600倍稀釋；空白對照為稀釋緩沖液（同上）。向包被有3A9單克隆抗體的多孔板的各列孔中分別加入不同稀釋倍數(shù)的無乳鏈球菌、陰性血清和對照稀釋鹽緩沖液（PBS）。加入量為每孔100μL。在37℃反應1小時后，用洗滌液洗滌3次除去未反應物，加入HRP標記的單克隆抗體4C12，37℃作用1小時后洗滌除去未反應物，加入新鮮配制的3'.3'.5，5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色，室溫顯色時間為20分鐘后加入終止液2mol/LH2SO450μL/孔終止反應，用酶標儀測所述多孔板各孔的OD450值。檢測結果見表1：表1檢測結果從表1的檢測結果可以看出隨著檢測標本中無乳鏈球菌濃度的降低，OD450值也隨之降低，空白對照的OD450值則遠低于檢測無乳鏈球菌的OD450值。實施例2與實施例1的不同在于用陰陽臨界值（OD450平均值）作為判斷檢測樣本中有無無乳鏈球菌的標準。本實施例中，采用以下工藝步驟制備檢測無乳鏈球菌雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒。（1）制備包被有3A9單克隆抗體的多孔板用碳酸鹽緩沖液即包被液（同上）將3A9單克隆抗體稀釋為濃度10.0μg/mL的稀釋液，然后將所述3A9單克隆抗體稀釋液加入多孔板的各孔內，置于4℃包被至少12小時，包被時間屆滿后，將質量濃度5%的脫脂奶粉溶液加入多孔板的各孔內，并在37℃進行封閉反應，封閉反應時間至少1小時以上，封閉反應結束后，用洗滌緩沖液（同上）洗滌多孔板，當多孔板上的未反應物被去除后即獲得包被有3A9單克隆抗體的多孔板，其保存溫度為4℃（一般在4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?。?）制備辣根過氧化物酶(HRP)標記的單克隆抗體4C12按常規(guī)方法：用雜交瘤細胞制備小鼠腹水單克隆抗體4C12，用正辛酸一飽和硫酸銨法提純，以BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測得單克隆抗體4C12的濃度為4.34mg/mL，單克隆抗體至-20℃保存?zhèn)溆谩RP標記4C12步驟如下：①稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。②于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，冰浴下避光攪拌15分鐘。③將上述溶液裝入透析袋中，用1mMpH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4小時換液一次，期間換液5次。④加20μl0.2MpH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mgIgG(經正辛酸一飽和硫酸銨粗提的4C12和經ProteinG親和層析純化的4C12)，冰浴避光攪拌2小時。⑤加0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混勻，再置4℃2小時。⑥將上述液裝入透析袋中，用0.15MpH7.4PBS透析，4小時換液一次，期間換液5次。⑦在冰浴攪拌下逐滴緩慢加入等體積飽和硫酸銨，置4℃2小時。⑧3000rpm離心30min，棄去上清。沉淀用半飽和硫酸銨洗2次，最后沉淀物溶于少量0.15MpH7.4的PBS中。⑨將上述溶液裝入透析袋中，用0.15MpH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，12000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，即酶標4C12，使用時，用稀釋緩沖液（同上）作1：1600倍稀釋。（3）用底物緩沖液配制3'.3'.5，5'-四甲基聯(lián)苯胺底物顯色液20000μL。所述顯色底物3'.3'.5，5'-四甲基聯(lián)苯胺為市售商品，可直接從市場購買。上述方法中，制備包被有3A9單克隆抗體的多孔板時，所述3A9單克隆抗體稀釋液的加入量為每孔100μL，所述辣根過氧化物酶(HRP)標記的單克隆抗體4C12稀釋液的加入量為100μL/孔，所述質量濃度5%的脫脂奶粉溶液的加入量為100μL/孔。本發(fā)明所述試劑盒及制備方法中，3A9單克隆抗體本質上為蛋白質，能特異識別無乳鏈球菌。本發(fā)明所述檢測無乳鏈球菌的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，檢測標本為感染動物（如羅非魚）的血清及腦、肝、脾、腎組織浸出液，所需儀器為酶標儀，使用方法如下：在包被有3A9單克隆抗體的多孔板的孔中加入待檢樣品，37℃反應1小時后，洗滌液洗滌3次除去未反應物，加入HRP標記的單克隆抗體4C12，37℃作用1小時后洗滌除去未反應物，加入新鮮配制的3'.3'.5，5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色，室溫顯色時間為20分鐘后加入終止液2mol/LH2SO450μL/孔終止反應，用酶標儀測所述多孔板各孔的OD450值。用本實施例制備的檢測無乳鏈球菌雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒對無乳鏈球菌和陰性血清進行檢測，操作如下：將無乳鏈球菌和陰性血清用稀釋緩沖液（同上）稀釋成表1中的稀釋倍數(shù)；用碳酸緩沖液（同上）將3A9單克隆抗體稀釋為濃度10.0μg/mL的稀釋液；將酶標4C12用稀釋緩沖液（同上）作1：1600倍稀釋；空白對照為稀釋緩沖液（同上）。向包被有3A9單克隆抗體的多孔板的各列孔中分別加入不同稀釋倍數(shù)的無乳鏈球菌、陰性血清和對照稀釋鹽緩沖液（PBS）。加入量為每孔100μL。在37℃反應1小時后，用洗滌液洗滌3次除去未反應物，加入HRP標記的單克隆抗體4C12，37℃作用1小時后洗滌除去未反應物，加入新鮮配制的3'.3'.5，5'-四甲基聯(lián)苯胺顯色，室溫顯色時間為20分鐘后加入終止液2mol/LH2SO450μL/孔終止反應，用酶標儀測所述多孔板各孔的OD450值。按照實施例2所述的檢測無乳鏈球菌雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測操作方法，向包被有3A9單克隆抗體的多孔板的各列孔中分別加入陰性血清、陽性對照血清和空白對照（PBS，同上）檢測樣品，檢測10份陰性血清樣本，以及陽性對照血清和空白對照，每份重復3孔，結果見表2，計算出其OD450的平均值及標準方差分別為：平均值（X）為0.1484，標準差（S）為0.0201，空白對照的數(shù)值為0.088±0.001，根據公式X＋3S計算得：陽性和陰性的結果判斷的臨界值為0.21，即在陰陽性對照成立的情況下，OD450大于0.21就可以判定為無乳鏈球菌陽性，否則，判為陰性。表2陰性樣本的測定結果Table5-5ResultsofDetectionthenegativesera樣品號12345678910OD值0.1310.1250.1230.1560.1590.1640.1460.1510.140.189判斷檢測樣本中無乳鏈球菌陰陽臨界值（OD450平均值）的確定。按照實施例1所述的檢測無乳鏈球菌雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測操作方法，向包被有3A9單克隆抗體的多孔板的各列孔中分別加入陰性血清、陽性對照血清和空白對照（PBS，同上）檢測樣品，檢測10份陰性血清樣本，以及陽性對照血清和空白對照，每份重復3孔，結果見表2，計算其OD450的平均值及標準方差。陰陽性臨界值=陰性樣本OD450平均值+3×標準方差。經計算陰性血清OD450平均值（X）=0.08427，標準方差（S）=0.015252。所以，陰陽性臨界值=0.08427+3×0.015252=0.130因此把判斷檢測樣本中大片吸蟲抗原陰陽臨界值定為0.130。用所述的檢測大片形吸蟲雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測樣本時，在陰陽對照成立的情況下，OD450大于0.130就可以判定為大片吸蟲抗原陽性，否則，判為陰性。表2陰性血清、陽性對照血清OD450值測定結果450血清樣品平均值血清樣品平均值10.085±0.00460.092±0.01620.092±0.00470.110±0.00130.085±0.01180.049±0.00440.074±0.00190.084±0.00250.085±0.006100.086±0.001空白對照Blank0.049±0.004陽性對照Positive1.501±0.089實施例3與實施例1和實施例2的不同在于用陰陽臨界值（OD450平均值）來判斷對無乳鏈球菌的特異性檢測效果。按照實施例1所述的檢測無乳鏈球菌雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測方法，檢測無乳鏈球菌、鰻弧菌（Vibrioanguillarum）、嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）、熒光假單胞菌（P.Fluorescens）、豚鼠單胞菌（Aeromonascaviae）、銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa）和施氏假單胞菌（Pseudomonasstutzer）并用SP2/0細胞（骨髓瘤細胞）作陰性對照，進行特異性驗證測定，結果見表3。表3檢測結果T菌液濃度（CFU/ml）1.5×108無乳鏈球菌1.021±0.072鰻弧菌0.088±0.007嗜水氣單胞菌0.130±0.003熒光假單胞菌0.120±0.053豚鼠氣單胞菌0.132±0.013銅綠假單胞菌0.123±0.009施氏假單胞菌0.115±0.017陰性對照0.121±0.043從表3的結果可以看出，無乳鏈球菌的OD450值為1.021±0.072，高于陰陽臨界值（陰陽臨界值為0.21），為陽性判斷，而鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、豚鼠單胞菌、銅綠假單胞菌、施氏假單胞菌檢測到的OD450值都遠低于陰陽臨界值，證明用所述的檢測無乳鏈球菌雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、豚鼠單胞菌、銅綠假單胞菌、施氏假單胞菌時，不與這些抗原發(fā)生交叉反應，說明所述的檢測無乳鏈球菌雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒具有良好的檢測特異性。實施例4與實施例1-3的不同在于用陰陽臨界值（OD450平均值）來判斷被檢測不同臨床樣品中有無無乳鏈球菌。采用無乳鏈球菌回歸感染的方法，用羅非魚人工感染無乳鏈球菌,感染劑量為1.5×105CFU（每毫升樣品中含有的細菌群落總數(shù)）/尾，感染12小時后采集感染羅非魚的肝臟、脾臟，按照實施例1所述的檢測無乳鏈球菌雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測方法檢測30份肝脾的組織浸出液樣本，結果見表4。從表4檢測結果可知，按照實驗確定的陰陽臨界OD450值（見實施例2）為0.21，實驗的陰陽對照和空白對照成立，在所檢測的30份肝脾的組織浸出液樣本，都能再肝臟或（和）脾臟檢測到無乳鏈球菌，檢測數(shù)據結果見表4。表4檢測結果魚編號肝組織浸出液OD450值脾組織浸出液OD450值10.8590.12220.2260.11531.1170.16840.3630.14850.3980.12860.1550.64370.1520.35980.1430.65290.2620.281100.1290.336110.4290.194120.0920.192130.1180.270140.2150.189150.1170.244160.0940.219170.3090.267180.8820.151190.0790.412200.0660.250210.0800.318220.1131.154230.0840.406240.0680.210250.8460.404260.2100.580270.1350.253280.1030.570290.1860.377300.1550.643陰性0.1050.145陰性0.1550.130本發(fā)明不局限于以上所述的具體實施方式，以上所述僅為本發(fā)明較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明保護范圍之內。當前第1頁1 2 3