本發(fā)明涉及一種鹽酸蘭地洛爾原料藥物中起始物料A的檢測方法，具體涉及一種采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定鹽酸蘭地洛爾原料藥物中起始物料A的方法。
背景技術(shù)：
：鹽酸蘭地洛爾是一種選擇性β1受體阻滯劑，主要拮抗存在于心臟的β1受體，通過抑制兒茶酚胺引起的心搏增加而改善心動過速性心律失常。目前，該藥在國內(nèi)還處于研究階段，主要針對國外過期專利進(jìn)行工藝改造，以達(dá)到降低用藥成本的目的。根據(jù)合作企業(yè)提供的鹽酸蘭地洛爾的合成路線，(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯(起始物料A)，其結(jié)構(gòu)式如下：(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯(起始物料A)是合成鹽酸蘭地洛爾的必備原料，但其即使在藥物原料中痕量存在，也會影響鹽酸蘭地洛爾藥物的使用安全性。如果采用常規(guī)的液相色譜方法檢測，不僅檢測靈敏度達(dá)不到要求，而且其中的主成分鹽酸蘭地洛爾對其檢測有比較大的干擾。因此，建立一種能夠檢測并控制合成鹽酸蘭地洛爾原料藥物中痕量起始物料A的含量的方法，對于保障該藥物的使用安全性具有十分重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種鹽酸蘭地洛爾原料藥物中起始物料A的檢測方法，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對鹽酸蘭地洛爾原料藥物中起始物料A進(jìn)行定量測定，該檢測方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)鹽酸蘭地洛爾原料藥物中痕量起始物料A的檢測。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：一種鹽酸蘭地洛爾原料藥物中起始物料A的檢測方法，包括：對鹽酸蘭地洛爾原料藥物進(jìn)行前處理的步驟，以及對前處理后的鹽酸蘭地洛爾原料藥物進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，采用外標(biāo)法對鹽酸蘭地洛爾原料藥物中起始物料A進(jìn)行定量分析的步驟。所述對鹽酸蘭地洛爾原料藥物進(jìn)行前處理，具體步驟為：將鹽酸蘭地洛爾原料藥物用稀釋溶劑溶解，超聲處理，離心，取上清液，作為檢測樣品。所述稀釋溶劑選自色譜甲醇。所述鹽酸蘭地洛爾原料藥物與稀釋溶劑加入量的比為1mg：0.5mL。所述超聲功率為250W或以上，超聲時(shí)間為8-15分鐘。超聲處理的目的是加速樣品溶解。所述離心速率為12000r/min，離心時(shí)間為5-15分鐘。所述液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，其中，液相色譜條件為：C18色譜柱，柱溫：30℃，進(jìn)樣量5-10μL，流速0.3-0.5mL/min，含0.1％(體積比)甲酸的水溶液和乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源(ESI源)，正離子模式檢測，毛細(xì)管電壓4000V，四極桿溫度100℃，霧化壓力35psig，干燥氣溫度330℃，干燥氣流量12L/min，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式。進(jìn)一步的，所述液相色譜條件為：XDB-C18色譜柱，柱溫：30℃，進(jìn)樣量5μL，流速0.4mL/min，含0.1％(體積比)甲酸的水溶液和乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。進(jìn)一步的，所述梯度洗脫的程序?yàn)椋簳r(shí)間(min)流動相A(％)流動相B(％)0802085951059510.18020128020其中，流動相A為含0.1％甲酸的水溶液，流動相B為乙腈。進(jìn)一步的，MRM的具體參數(shù)設(shè)置如下：所述采用外標(biāo)法對鹽酸蘭地洛爾原料藥物中起始物料A進(jìn)行定量分析的步驟為：配制10ng/mL-200ng/mL的起始物料A的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度梯度5個(gè)以上且均勻分布；利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行檢測，以目標(biāo)物濃度為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)做回歸曲線，計(jì)算回歸方程及相應(yīng)的線性回歸系數(shù)；然后在相同條件下對樣品進(jìn)行檢測，將得到的起始物料A的峰面積代入回歸方程中，即可計(jì)算得出起始物料A的含量。本發(fā)明中，由于起始物料A在鹽酸蘭地洛爾原料藥物中多以痕量存在，所以需要對鹽酸蘭地洛爾原料藥物進(jìn)行預(yù)處理，目的是使起始物料A最大限度的溶出，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明對鹽酸蘭地洛爾原料藥物進(jìn)行預(yù)處理方法進(jìn)行了優(yōu)化考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用如下方法對原料藥物進(jìn)行預(yù)處理：將鹽酸蘭地洛爾原料藥物用稀釋溶劑溶解，鹽酸蘭地洛爾原料藥物與稀釋溶劑加入量的比為1mg：0.5mL，超聲處理，離心，取上清液，作為檢測樣品；超聲功率為250W或以上，超聲時(shí)間為8-15分鐘，離心速率為12000r/min，離心時(shí)間為5-15分鐘。相對于其他預(yù)處理方法，采用本發(fā)明的上述預(yù)處理方法，可以最大限度的將起始物料A溶出，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明中，建立合適的液相色譜條件，目的是讓化合物能夠?qū)崿F(xiàn)良好的分離，使目標(biāo)化合物不受其他物質(zhì)的干擾。在本發(fā)明的液相色譜條件中，流動相的流速低則出峰慢，流速高則出峰快，色譜柱內(nèi)徑小則出峰較快，內(nèi)徑大則出峰相對較慢；另外，梯度洗脫程序是影響目標(biāo)物分離效果的關(guān)鍵因素。本發(fā)明對流動相的流速、色譜柱等液相色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化考察，特別是對梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，采用本發(fā)明優(yōu)化后的梯度洗脫程序能夠在最短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的良好分離。本發(fā)明中，質(zhì)譜條件的建立依據(jù)是讓目標(biāo)物的豐度最大，信噪比最高。液相色譜條件和質(zhì)譜條件是根據(jù)目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和豐度來調(diào)節(jié)的，采用本發(fā)明的檢測方法，最大限度的降低了對于起始物料A的檢測限。本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明利用高效液相色譜-四級桿串聯(lián)質(zhì)譜，建立了鹽酸蘭地洛爾原料藥物中(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯的檢測方法。本方法的檢測靈敏度可達(dá)到0.50mg/kg，且方法的精密度和回收率均能滿足(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯的檢測要求。本發(fā)明操作簡單、結(jié)果可靠，可實(shí)現(xiàn)鹽酸蘭地洛爾原料藥物中痕量(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯的快速、低成本檢測。(2)本發(fā)明對檢測過程中液相色譜和質(zhì)譜的操作參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化選擇，使得檢測時(shí)間短，同時(shí)又保證了檢測的特異性、準(zhǔn)確性和靈敏性。此外，為進(jìn)一步的提高檢測的準(zhǔn)確性，發(fā)明人對樣品進(jìn)行了預(yù)處理，預(yù)處理的操作方法簡單。本發(fā)明通過樣品的預(yù)處理和檢測過程的相互配合，使得本發(fā)明的檢測方法能夠用于鹽酸蘭地洛爾原料藥物中(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯的痕量檢測，保證了鹽酸蘭地洛爾原料藥物的使用安全性。附圖說明圖1：(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2：鹽酸蘭地洛爾空白樣品檢測質(zhì)譜圖；圖3：鹽酸蘭地洛爾空白樣品加標(biāo)(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯的檢測質(zhì)譜圖。具體實(shí)施方式結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進(jìn)行限定。下述實(shí)施例中使用的主要儀器有：Agilent-1200型快速分離高效液相色譜(美國安捷倫科技有限公司)，6410型三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜(QQQ)(美國安捷倫科技有限公司)；Vortex-5型渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；HeraeusMultifugeX1R型高速冷凍離心機(jī)(美國賽默飛世爾科技公司)；AL104型天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；0.5-10μL移液器(德國艾本德公司)；20-200μL移液器(德國艾本德公司)；100-1000μL移液器(德國艾本德公司)。下述實(shí)施例中使用的主要試劑有：(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品(武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工有限公司)；色譜級甲醇(瑞典OceanPak公司)；色譜級甲酸(美國ROE科技公司)；色譜級乙腈(瑞典OceanPak公司)；哇哈哈飲用純凈水(杭州哇哈哈集團(tuán)有限公司)。實(shí)施例1：鹽酸蘭地洛爾原料藥物中起始物料A的檢測具體步驟如下：(1)樣品的前處理準(zhǔn)確稱取鹽酸蘭地洛爾原料約20.0mg，置于10mL容量瓶中，精密加入稀釋溶劑至刻度，搖勻后超聲10分鐘，精密轉(zhuǎn)移1.0mL至離心管中12000r/min離心10分鐘后，取上清液進(jìn)樣5μL檢測。(2)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測采用高效液相色譜/質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算鹽酸蘭地洛爾原料藥物中起始物料A的含量。液相色譜儀的參數(shù)條件為：XDB-C18色譜柱，柱溫：30℃，進(jìn)樣量5μL，流速0.4mL/min，流動相A：含0.1％(體積比)甲酸的水溶液，流動相B：乙腈，梯度洗脫程序如表1所示：表1：串聯(lián)質(zhì)譜儀的參數(shù)條件為：電噴霧離子源(ESI源)，正離子模式檢測，毛細(xì)管電壓4000V，四極桿溫度100℃，霧化壓力35psig，干燥氣溫度330℃，干燥氣流量12L/min，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式。MRM的具體參數(shù)設(shè)置如表2所示：表2：(3)配制10ng/mL-200ng/mL的起始物料A的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，具體方法如下：(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制：準(zhǔn)確稱取(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品0.0100g，利用校準(zhǔn)后的移液器準(zhǔn)確加入1000μL的色譜級甲醇溶液溶解，配成濃度為10.0mg/mL的(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)溶液。將1000μL的1.00mg/mL的(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)溶液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，色譜級甲醇溶液稀釋并定容至刻度，配成濃度為1.00mg/mL的(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液I。準(zhǔn)確移取1000μL濃度為1.00mg/mL的(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液至100mL容量瓶中，加入色譜級甲醇至刻度，配成濃度為10.0μg/mL的(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液II，備用。精密量取(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液II1.0mL于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成濃度為1.00μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后用甲醇逐級稀釋配置成濃度分別為200ng/mL、160ng/mL、100ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL的起始物料A標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。上述溶液各進(jìn)樣5.0μL，記錄峰面積。以目標(biāo)物濃度與內(nèi)標(biāo)濃度的比值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)做回歸曲線，計(jì)算回歸方程及相應(yīng)的線性回歸系數(shù)。(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見圖1和表3。表3：然后在相同條件下對樣品進(jìn)行檢測，將得到的起始物料A的峰面積代入回歸方程中，即可計(jì)算得出起始物料A的含量。3批實(shí)際樣品中起始物料A的含量檢測結(jié)果見表4；表4：實(shí)施例2：本發(fā)明檢測方法的方法學(xué)考察1.專屬性(1)鹽酸蘭地洛爾原料空白樣品的配制(2.0mg/mL)：精密稱定空白鹽酸蘭地洛爾樣品20.0mg，置于10mL量瓶中，加稀釋溶劑至刻度，搖勻后超聲10分鐘，作為空白樣品溶液。移取1.0mL至離心管中，12000r/min離心10分鐘后，取上清液進(jìn)樣5.0μL，按實(shí)施例1的液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜檢測條件檢測，質(zhì)譜圖如圖2所示。(2)鹽酸蘭地洛爾原料藥加標(biāo)(起始物料A)樣品溶液的配制：準(zhǔn)確稱取鹽酸蘭地洛爾樣品20.0mg，置于10mL量瓶中，準(zhǔn)確加入濃度為2.0mg/mL的(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL，加稀釋溶劑至刻度。搖勻后超聲10分鐘，作為空白樣品加標(biāo)溶液。移取1.0mL至離心管中，12000r/min離心10分鐘后，取上清液進(jìn)樣5.0μL，按實(shí)施例1的液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜檢測條件檢測，質(zhì)譜圖如圖3所示。由圖2和圖3可以看出，空白的鹽酸蘭地洛爾原料中未檢出起始物料A，而加標(biāo)的鹽酸蘭地洛爾原料中起始物A有檢出，說明鹽酸蘭地洛爾對起始物料A的檢測無干擾，該方法起始物料A的檢測靈敏度高。2.精密度準(zhǔn)確配制濃度為80ng/mL的起始物料A標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次5.0μL，考察檢測方法的精密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。表5：進(jìn)樣次數(shù)起始物料A的峰面積平行1437828.5789平行2424975.1409平行3430663.8039平行4414880.109平行5392250.6115平行6388165.0621平均值414793.8844RSD(％)4.943.定量限及檢出限用甲醇逐級稀釋(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液II，配制濃度為10.0ng/mL的(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為起始物料A的定量限濃度，平行做三組，各進(jìn)樣5.0μL檢測，檢測結(jié)果如表6所示。用甲醇逐級稀釋(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液II，配制濃度為1.0ng/mL的(S)-(+)-間硝基苯磺酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為起始物料A的檢出限濃度，平行做三組，各進(jìn)樣5.0μL檢測，檢測結(jié)果如表6所示。表6：結(jié)果表明，起始物料A最終的定量限為5.00mg/kg，檢測限為0.50mg/kg。4.加標(biāo)回收率空白樣品溶液：精密稱定鹽酸蘭地洛爾樣品20.0mg，置10mL量瓶中，加稀釋溶劑至刻度，搖勻后超聲10分鐘，作為空白樣品溶液。平行制備3份。加樣回收率試驗(yàn)溶液：稱取三份取鹽酸蘭地洛爾樣品20.0mg，置10mL量瓶中，分別加入起始物料A標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度1.0μg/mL)1.6mL、0.8mL及0.2mL，再加稀釋溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻后超聲10分鐘，作為加標(biāo)濃度為160ng/mL、80ng/mL及20ng/mL的加樣回收率試驗(yàn)溶液。每個(gè)濃度平行制備3份。利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣上述溶液各5.0μL，記錄樣品峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表7。表7：從表7中可以看出，利用本發(fā)明檢測起始物料A，不僅空白樣品無干擾，而且三個(gè)濃度點(diǎn)的加標(biāo)回收率的范圍在93.18％～103.3％之間，完全滿足檢測靈敏度的要求。當(dāng)前第1頁1 2 3