本發(fā)明涉及一種實時檢測大氣顆粒物生物毒性的分析技術，具體是利用基因熒光探針標記控制活體酵母菌氧化應激相關特異性蛋白的基因，使活體酵母菌作為大氣顆粒物毒性的指示微生物，通過實時檢測特定波長不同熒光蛋白表達濃度反演大氣顆粒物的生物毒性，可應用于大氣顆粒物及生物成分對人體造成的健康效應的評估方法。

背景技術：

近年來，中國多地頻發(fā)重度霧霾，許多工作致力于研究其成霾的機理，其中燃煤、車尾氣等列為重要的貢獻源。大氣顆粒物吸入后對于人體健康會造成一定的損害，包括引起呼吸道感染、過敏反應、癌癥和嬰兒的出生缺陷等等。最近幾年越來越多的研究表明大氣顆粒物的生物組分對其生物毒性具有非常重要的影響,包括血壓增加等心血管疾病等。生物氣溶膠顆粒作為一種特殊的顆粒物，具有獨特的健康效應，主要表現(xiàn)在它能造成呼吸系統(tǒng)感染、導致過敏和毒性反應等三個方面。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組成部分，其存在于大氣的顆粒物中。每毫克PM中平均含有30EU的內(nèi)毒素。人體吸入內(nèi)毒素后能夠引起一系列的炎癥、過敏以及免疫反應，對人體健康會造成一定的影響。有報道顯示0.1μg的內(nèi)毒素就會引起人類的免疫反應。大量研究成果表明，大氣顆粒物中含有的內(nèi)毒素會在一定程度上增加顆粒物的生物毒性。

大氣顆粒物的毒性是生物與化學成分共同作用的結果，忽略其中任何一部分成分的研究結果都會具有局限性。利用小鼠或呼吸系統(tǒng)上皮細胞的模型，通過暴露高濃度的大氣顆粒物來觀測其生物毒性與健康效應。但是，所用的小鼠或呼吸系統(tǒng)上皮細胞模型的靈敏度差，常常需要較高濃度的顆粒物才能觀測到其生物效應，這與實際大氣環(huán)境濃度有一定的差距，不能夠很好地反推真實大氣顆粒物毒性水平。大氣顆粒物的毒性的監(jiān)測需要全組分的高靈敏度的監(jiān)測體系。國內(nèi)外目前尚還沒有發(fā)展出這種技術。

近年來，活體酵母菌作為一種活體傳感器越來越受到關注，其中有關釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的研究最多。酵母菌通過表達特定蛋白來完成對外界環(huán)境刺激的響應。例如，酵母菌對外界活性氧(ROS)的特異性蛋白在外界活性氧的刺激下會顯著增多，同時酵母菌對外界金屬離子的刺激也會有特定的蛋白表達。研究表明顆粒物的氧化應激損傷是顆粒物健康效應的重要方式。此外，多項研究報道，酵母菌作為最簡單的真核生物，其多種致病基因與人類的致病基因極其相似，所以利用酵母菌作為活體檢測生物能夠很好的推廣到大氣顆粒物對于人體健康效應的評估中去。

技術實現(xiàn)要素：

為實現(xiàn)大氣顆粒物對于人體的健康效應的生物毒性評估，本發(fā)明提供了一種利用基因熒光探針標記控制特異性蛋白表達的基因的活體酵母作為毒性指示微生物，結合酶標儀檢測其熒光值的變化，從而分析大氣顆粒物的毒性。本發(fā)明篩選出的酵母菌對氧化應激有特異性靈敏響應的蛋白為SSA1和HSP60兩種。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種實時檢測大氣顆粒物生物毒性的方法，是利用熒光蛋白標記的活體酵母菌作為指示微生物，分析大氣顆粒物毒性的方法，包括如下步驟：

1)采集大氣顆粒物(主要是PM2.5顆粒)，溶于水中制成一定濃度的大氣顆粒物溶液；

2)培養(yǎng)SSA1和/或HSP60蛋白基因被熒光探針標記的酵母菌，制成一定濃度的酵母指示菌液；

3)將一定量的步驟1)中獲得的大氣顆粒物溶液與步驟2)中制備的酵母指示菌液混合，利用光學方法獲取其特定波長熒光值，分析大氣顆粒物的毒性。

上述步驟1)可利用TEFLON采樣膜以及四通道大氣顆粒物采樣器采集大氣中PM2.5的樣品，采樣時間為24h，采樣流量為100L/min；然后稱量采集到的樣品，將其溶解在水中，優(yōu)選制成濃度≥0.02mg/mL的大氣顆粒物溶液，更優(yōu)選為0.04mg/mL的大氣顆粒物溶液。

上述步驟2)中，酵母蛋白HSP60和SSA1對氧化應激有靈敏響應，是發(fā)明人通過實驗篩選出來的對大氣顆粒物有響應的蛋白。優(yōu)先選擇綠色熒光蛋白(GFP)作為基因熒光探針標記控制這兩種蛋白表達基因的酵母菌。特異性表達GFP標記的功能蛋白酵母菌菌株可以通過商業(yè)途徑購得，也可以通過基因工程技術構建GFP和功能蛋白的融合基因，并獲得轉(zhuǎn)化的酵母菌菌株。GFP和功能蛋白的融合基因在酵母菌受到特異性外界刺激時進行表達，發(fā)出特異性的綠色熒光。

步驟2)可以將所述酵母菌在25℃的搖床中培養(yǎng)48小時，可制成濃度≥10⁴個/mL(例如10⁸個/mL)的酵母指示菌液備用。

上述步驟3)可以將樣品加入到96孔板中，利用光學儀器如酶標儀讀取96孔板的熒光值。設置動態(tài)連續(xù)讀取熒光值，每隔一定時間(例如1分鐘)讀取一次熒光值，讀取多次，讀取時長優(yōu)選為2小時。對于GFP標記的功能蛋白酵母菌菌株，酶標儀檢測的熒光波長范圍為480～520nm。

本發(fā)明通過熒光標記的特異性活體酵母菌作為指示微生物，利用酶標儀系統(tǒng)，檢測大氣顆粒物的生物毒性。本發(fā)明為大氣顆粒物生物毒性的研究提供新的方法。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：

(1)本發(fā)明提出和創(chuàng)建了利用活體酵母菌作為指示微生物檢測大氣顆粒物的檢測體系。

(2)本發(fā)明篩選出了兩種酵母菌在大氣顆粒物刺激下能夠靈敏響應，特異性表達的蛋白。

(3)本發(fā)明的系統(tǒng)對大氣顆粒物中的成分響應有選擇性，可以監(jiān)測特定成分毒性水平，如重金屬鐵、銅等；

(4)不同于現(xiàn)有的大氣顆粒物毒性實驗，本發(fā)明提出在單個活體酵母菌水平上檢測大氣顆粒物的毒性，具有高靈敏度、低檢測限等特點；

(5)不同于現(xiàn)有的主要以顆粒物質(zhì)量濃度為單位來衡量空氣質(zhì)量的大氣顆粒監(jiān)測手段，該系統(tǒng)能夠?qū)崟r在線監(jiān)測特定大氣條件下空氣的生物毒性。

附圖說明

圖1.實施例1利用SSA1蛋白檢測大氣顆粒物生物毒性的實驗結果。

圖2.實施例1利用HSP60蛋白檢測大氣顆粒物生物毒性的實驗結果。

圖3.實施例2利用SSA1蛋白檢測內(nèi)毒素生物毒性的實驗結果。

圖4.實施例2利用HSP60蛋白檢測內(nèi)毒素生物毒性的實驗結果。

具體實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進，只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

下述實施例中所用到的GFP標記功能蛋白為SSA1和HSP60，這兩種酵母菌蛋白是氧化應激反應時特異性表達的蛋白，對于大氣顆粒物的刺激能夠快速、靈敏響應。實施例中所用到的酵母菌來源于從日本酵母基因源中心購買的裂殖酵母(Schizosaccharomyces)探針菌株AY160-14D。本領域技術人員也可以利用基因工程技術自行構建GFP標記特定蛋白的酵母菌，該方法屬于公知技術，于此不再贅述。

實施例1.檢測大氣顆粒物的生物毒性

(1)利用Teflon采樣膜和四通道大氣顆粒物采樣器采集北京大氣中的PM2.5顆粒物，采樣時間為24小時。稱取采樣膜上大氣顆粒物的質(zhì)量后將其溶解在超純水溶液中，制成濃度為0.04mg/mL的顆粒物溶液；

(2)將上述顆粒物溶液溶液加入96孔板中，分別加入利用GFP標記的控制SSA1和HSP60蛋白表達基因片段的酵母菌菌液；

(3)將96孔板放入酶標儀中，利用酶標儀動態(tài)監(jiān)測96孔板中各實驗組熒光值的變化，酶標儀每隔1分鐘讀取一個熒光值，讀取時間為2小時，讀取波長為480～520nm；

(4)對酶標儀記錄的熒光值進行分析，2小時后其熒光值檢測結果如圖1和圖2所示。

實驗結果：

1.從圖1可以看出，與陰性對照組相比，當加入大氣顆粒物后，酵母菌SSA1蛋白的表達量在檢測的30min后開始顯著上升，這種上升趨勢一直維持到檢測終點(2h后)；

2.從圖2可以看出，HSP60蛋白對于大氣顆粒物的反應更為靈敏，在加入大氣顆粒物后，酵母菌HSP60的蛋白表達量立刻升高，且這種升高趨勢一直維持到檢測終點(2h后)。

實驗結論：

該實驗方法能夠有效檢測大氣顆粒物的生物毒性，該反應體系能夠做到靈敏快速反應，并能夠觀察毒性的實時變化，同時能夠?qū)ι锒拘赃M行半定量標定。

實施例2.檢測內(nèi)毒素的生物毒性

(1)將購買的濃度為50ng/mL內(nèi)毒素樣品稀釋為0.5ng/mL備用；

(2)將上述內(nèi)毒素溶液加入96孔板中，分別加入利用GFP標記的控制SSA1和HSP60蛋白表達基因片段的酵母菌菌液；

(3)將96孔板放入酶標儀中，利用酶標儀動態(tài)監(jiān)測96孔板中各實驗組熒光值的變化，酶標儀每隔1分鐘讀取一個熒光值，讀取時間為2小時，讀取波長為480～520nm；

(4)對酶標儀記錄的熒光值進行分析，2小時后其熒光值檢測結果如圖3和圖4所示。

實驗結果：

1.從圖3可以看出，與陰性對照組相比，當加入內(nèi)毒素后，酵母菌SSA1蛋白的表達量在檢測的30min后開始顯著上升，這種上升趨勢一直維持到檢測終點(2h后)；

2.HSP60蛋白對于內(nèi)毒素的反應更為靈敏，在加入內(nèi)毒素后，酵母菌HSP60的蛋白表達量立刻升高，且這種升高趨勢一直維持到檢測終點(2h后)。

實驗結論：

該驗方法能夠有效檢測內(nèi)毒素的生物毒性，并且檢測限較低。該反應體系能夠做到靈敏快速反應，并能夠觀察毒性的實時變化，同時可以對內(nèi)毒素的生物毒性進行半定量標定。

實施例3.比較不同城市大氣顆粒物的生物毒性

1.利用四通道大流量大氣顆粒物采樣器和TEFLON采樣膜采集北京、廣州、蘭州、?？诘炔煌鞘械腜M2.5樣品。

2.將采集到的樣品制成濃度大于0.02mg/mL的顆粒物溶液備用。

3.將上述顆粒物溶液加入96孔板中，分別加入利用GFP標記的控制SSA1和HSP60蛋白表達基因片段的酵母菌菌液。

4.將96孔板放入酶標儀中，利用酶標儀動態(tài)監(jiān)測96孔板中各實驗組熒光值的變化，酶標儀每隔1分鐘讀取一個熒光值，讀取時間為2小時，讀取波長為480～520nm。

5.對于各城市顆粒物樣品的熒光值進行分析，通過熒光值的相對強弱來說明各城市間大氣顆粒物生物毒性的相對強弱關系。

本方法將指示酵母菌與酶標儀檢測相結合，實現(xiàn)了對于不同種類物質(zhì)的同一毒性指標進行檢測，同時對比分析其毒性的差異。利用酶標儀與指示酵母菌相結合為大氣顆粒物生物毒性機理的揭示提供了新的研究手段。

此外該方法如果能夠配合微流控實時在線送樣系統(tǒng)，就可以實現(xiàn)對于大氣顆粒物生物毒性的實時在線檢測，并對其生物毒性進行實時在線半定量標定。