本發(fā)明涉及的是一種酶聯(lián)免疫吸附檢測領(lǐng)域的技術(shù)，具體是一種基于移動反應(yīng)界面電泳滴定(moving reaction boundary‐electrophoresis titration,MRB‐ET)的定量酶聯(lián)免疫吸附檢測方法。

背景技術(shù)：

1971年Engvall和Perlmann介紹了一種酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme‐linked immune sorbentassay，ELISA)用于IgG定量檢測的方法，將之前用于抗原定位的酶標抗體技術(shù)發(fā)展成液體標本中微量物質(zhì)的檢測方法(E.Engvall,P.Perlmann,1971,Immunochemistry,8,871‐874.)。該方法的基本原理是：將一抗結(jié)合到某種固相載體表面；將酶與二抗連接成為酶標抗體；檢測時，把受檢樣品和酶標抗體按不同步驟與固相載體表面進行反應(yīng)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與樣品中待檢測抗原的量成一定比例；加入反應(yīng)底物后，底物在酶催化作用下變成顯色產(chǎn)物，其濃度與樣品中待測抗原濃度直接相關(guān)，故可通過顏色反應(yīng)的深淺程度進行定性和定量分析(李志勇，2009，食品安全ELISA快速檢測技術(shù)，中國標準出版社，P2‐3)。

ELISA中酶的催化頻率很高，可以極大地放大反應(yīng)效果，使該方法具有很高的靈敏度(C.M.Maragos,R.D.Plattner,S.D.Miklasz,1996,Food Additives&Contaminants,13,105‐113.)。但該方法對檢測裝置和檢測環(huán)境有一定要求，通常需要洗板機、酶標儀、熒光檢測或化學發(fā)光檢測等較為復雜的儀器完成檢測。同時為了消除各種干擾，ELISA需要在穩(wěn)定的實驗室環(huán)境中進行檢測。上述因素使該方法無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢測、床邊診斷和野外分析。針對這些問題，已發(fā)展了ELISA分析新技術(shù)，包括：熒光探針微量顯色技術(shù)(G.C.Visor，S.G.Schulman,1981,Journal of Pharmaceutical Sciences,70,469‐475)和微流控芯片技術(shù)(N.N.Ye,J.H.Qin,W.W.Shi,X.Liu,B.C.Lin,2007,Lab onaChip,7,1696‐1704)等。以上技術(shù)能明顯減少酶反應(yīng)體系體積，向小型化邁出了重要一步。但上述方法仍基于傳統(tǒng)比色、熒光或化學發(fā)光儀器分析模式，檢測設(shè)備體積仍然龐大，限制了其在現(xiàn)場、床邊檢測和野外檢測分析中的應(yīng)用。

膠體金免疫層析法能夠?qū)崿F(xiàn)便攜式現(xiàn)場檢測分析(W.Faulk,G.M.Taylorn,1971,Immunochemistry,8,1081‐1087)。膠體金是由氯金酸在還原劑(如抗壞血酸、枸櫞酸鈉等)作用下聚合成一定大小的金納米顆粒，因靜電作用形成穩(wěn)定的帶負電的疏水膠體。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質(zhì)、酶、毒素、激素、抗生素等正電荷基團形成牢固的結(jié)合。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學特性，使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領(lǐng)域的免疫學分析。但膠體金免疫層析法只能實現(xiàn)定性或半定量檢測，不能實現(xiàn)準確定量檢測。

因此，亟待發(fā)展微型便攜式定量免疫學檢測技術(shù)。有關(guān)移動反應(yīng)界面電泳滴定的研究為上述問題的解決提供了新原理和新途徑(H.Y.Wang,Y.T.Shi,J.Yan,J.Y.Dong,S.Li,H.Y.Xie,L.Y.Fan,C.X.Cao,2014,Analytical Chemistry,86,2888‐2894)。MRB‐ET是指堿性(酸性)待測物質(zhì)在電場作用下與電泳通道內(nèi)的酸性(堿性)溶液發(fā)生持續(xù)的中和反應(yīng)形成移動反應(yīng)界面(MRB)，通過MRB移動速度與待測物質(zhì)濃度之間的關(guān)系檢測待測物濃度的技術(shù)。MRB‐ET已用于乳品食品蛋白含量測定，解決了長期困擾凱氏定氮技術(shù)的非蛋白氮(NPN)干擾的問題(CN102680556,CN201310089084)以及乳品食品以次摻好定量分析的問題(CN201510542254,CN105136953)。此外，MRB‐ET還成功的用于測定過氧化物酶活性，有效地對各項酶學指標進行快速測定(CN201610021350)。MRB‐ET最顯著的優(yōu)點是形成的MRB能夠用裸眼直接觀測，極大簡化了檢測裝置，無需信號檢測儀器，為微型化免疫學定量分析創(chuàng)造了條件。目前為止，MRB‐ET技術(shù)尚未應(yīng)用到酶聯(lián)免疫吸附檢測分析中，因此有必要開發(fā)一種通過MRB‐ET定量檢測酶催化產(chǎn)物濃度進而定量檢測目標抗體、抗原、或半抗原的新技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種基于移動反應(yīng)界面電泳滴定的定量酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，通過對已知濃度的標準樣品進行酶聯(lián)免疫吸附‐移動反應(yīng)界面電泳滴定(ELISA‐MRB‐ET)檢測，得到MRB移動距離與抗原濃度的數(shù)學模型并進行校正，對樣品可根據(jù)其MRB移動距離直接讀出其待測抗原濃度。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明通過在相同條件下分別對抗原濃度不同且已知的標準樣品進行ELISA‐MRB‐ET，從而建立移動反應(yīng)界面的移動距離與抗原濃度的數(shù)學模型，并沿電泳通道標注抗原濃度標尺；在測試階段通過對待測樣品在相同條件下進行ELISA‐MRB‐ET，測得的移動反應(yīng)界面的停留位置所應(yīng)的濃度刻度即為樣品中的抗原濃度。

所述的ELISA‐MRB‐ET包括：ELISA測定和移動反應(yīng)界面電泳滴定(MRB‐ET)，其中：MRB‐ET滴定通過滴定ELISA酶催化產(chǎn)物間接實現(xiàn)抗原濃度檢測，ELISA測定通過抗原與固相一抗結(jié)合，洗去未結(jié)合物質(zhì)后加入酶標二抗進行孵育，洗去未結(jié)合的酶標二抗，形成的抗原抗體復合物，滴加底物后在酶的催化作用下形成帶有顏色的弱堿性/弱酸性的酶催化產(chǎn)物，酶催化產(chǎn)物生成發(fā)光或吸光產(chǎn)物。

所述的ELISA測定中的酶標二抗的酶為辣根過氧化物酶；底物為魯米諾和過氧化氫組合。

所述的移動反應(yīng)界面電泳滴定通過以下方式實現(xiàn)：弱堿性/弱酸性的酶催化產(chǎn)物在兩端施加電場的電泳通道內(nèi)向陽極/陰極移動，與電泳通道內(nèi)的填充介質(zhì)中的緩沖溶液相遇并發(fā)生中和反應(yīng)，發(fā)生明顯的顏色變化。

所述的電泳通道兩端分別設(shè)有陰極室和陽極室。

所述的填充介質(zhì)為凝膠支持介質(zhì)或全液相介質(zhì)。

所述的凝膠支持介質(zhì)采用但不限于：瓊脂糖或聚丙烯酰胺。

所述的背景緩沖溶液為與弱堿性/弱酸性的酶催化產(chǎn)物相對應(yīng)的弱酸性/弱堿性溶液。

所述的移動反應(yīng)界面還包括：移動絡(luò)合界面、移動氧化還原界面、移動沉淀界面和移動親和界面。

所述的數(shù)學模型具體為：其中：C_antigen為抗原濃度，d_MRB為MRB的移動距離，t₁為電泳時間，在實驗條件一致的情況下h、k和i為常數(shù)，通過標準樣品濃度與對應(yīng)的MRB移動距離擬合得到。

技術(shù)效果

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明省去了光密度、熒光、或化學發(fā)光檢測器，將各種光信號轉(zhuǎn)化成簡單的可視化長度度量，由裸眼或成像直接讀出，極大地簡化了酶聯(lián)免疫吸附檢測，降低成本；并且由于電泳能夠?qū)嵭胁⑿嘘嚵屑夹g(shù)，可實現(xiàn)高通量檢測。

附圖說明

圖1為陰極室內(nèi)酶聯(lián)免疫吸附的原理圖；

圖2為MRB‐ET滴定原理示意圖，t₁時未施加電場，施加電場t₂后MRB移動距離為d；

圖3為SEB型腸毒素于標有待濃度刻度的電泳通道陣列中的檢測示意圖。

具體實施方式

下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。

實施例1

如圖1～3所示，本實施例通過在相同條件下，對濃度不同且已知的SEB型腸毒素的標準樣品進行ELISA‐MRB‐ET檢測，并建立MRB移動距離與底物濃度的函數(shù)關(guān)系、沿電泳通道標注濃度標尺；在樣品檢測中，使用相同的條件進行ELISA‐MRB‐ET檢測，形成的MRB的停留位置所應(yīng)的濃度刻度即為樣品中底物濃度；具體包括以下步驟：

步驟1、在電泳通道內(nèi)填充凝膠并進行一抗包被和封閉。

所述的電泳通道為直型電泳通道，其長寬高分別為20mm、1.0mm和0.5mm。

所述的電泳通道兩端分別設(shè)有陰極室和陽極室。

所述的填充凝膠是指：將電泳通道依次使用100mM的氫氧化鈉溶液和去離子水各沖洗10min后在分離通道內(nèi)快速注入加熱融化的瓊脂糖，冷卻凝固。

所述的瓊脂糖凝膠內(nèi)含有100mM KCl，100mM Tris-HCl(pH 6.0)背景緩沖溶液。

所述的背景緩沖溶液在MRB‐ET過程中對酶催化產(chǎn)物能夠起到電遷移阻滯效應(yīng)。

所述的一抗包被是指：將10mg/L的200μL單抗1D2作為一抗在42℃的條件下孵育5h后包被陰極室，并用磷酸緩沖液清洗3次。

所述的封閉是指：使用200μL，1％的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封閉板上的空白位點，并在37℃的條件下孵育30min，用磷酸緩沖溶液清洗3次，洗凈未吸附物質(zhì)。

步驟2、配制標準樣品，在陰極室內(nèi)進行酶聯(lián)免疫吸附，并在電泳通道內(nèi)進行MRB‐ET檢測。

所述的標準樣品通過以下方法配制：采用磷酸鹽緩沖液將SEB標準品倍比稀釋為10μg/L、5μg/L、2.5μg/L、1.25μg/L、0.625μg/L和0μg/L六個濃度。

所述的酶聯(lián)免疫吸附包括以下步驟：

S1：五個稀釋濃度的標準樣品中的抗原(SEB)分別與陰極室內(nèi)的固相一抗結(jié)合，100μL標準樣品和固相一抗的混合物在37℃的條件下孵育30min后用磷酸緩液清洗3次，洗去未結(jié)合物質(zhì)后加入1μg/mL、100μL辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗2D1在37℃的條件下孵育15min后，用磷酸緩沖液清洗3次，形成抗原抗體復合物。

S2：各陰極室分別加入濃度為80mM的魯米諾和過氧化氫各50μL，反應(yīng)30min，形成弱堿性的酶催化產(chǎn)物。

所述的MRB‐ET檢測是指：對各標準樣品的酶催化產(chǎn)物施加12V的分離電壓，持續(xù)30s后停止電泳，讀取MRB移動距離。

所述的MRB通過以下方式形成：帶有負電荷的酶催化產(chǎn)物(激發(fā)態(tài)魯米諾)在電泳通道內(nèi)向陽極室移動，與瓊脂糖凝膠中的酸性緩沖溶液相遇并發(fā)生中和反應(yīng)，激發(fā)態(tài)魯米諾猝滅發(fā)生顏色變化。

步驟3、根據(jù)標準樣品的抗原濃度和對應(yīng)的MRB移動距離，得到MRB的移動距離與抗原濃度的散點圖，對散點圖按照MRB移動距離與抗原濃度之間的函數(shù)公式進行擬合，得到MRB移動距離和抗原濃度的校正數(shù)學模型。

所述的MRB移動距離與抗原濃度的數(shù)學模型為：其中：C_antigen為抗原濃度，d_MRB為MRB的移動距離，t₁為電泳時間，相同的ELISA‐MRB‐ET的實驗條件下h、k和i為常數(shù)。

所述的MRB移動距離與抗原濃度的數(shù)學模型根據(jù)以下關(guān)系得到：在MRB‐ET檢測時，MRB以一定速度向陽極移動，其移動速度(v_MRB)受到酶催化產(chǎn)物的濃度(C_prodcut)和電泳速度(v_prodcut)，以及氫離子成分濃度和成分速度的共同影響，即而電泳通道中的緩沖溶液恒定不變，且緩沖溶液中酸的濃度遠遠大于酶催化產(chǎn)物濃度，即存在：而在標準樣品和樣品檢測中均采用相同的實驗條件，因此電場恒定不變，存在：v_product＝constant 3；結(jié)合上述方程，可得：C_product＝av_MRB+b，其中：a和b為常數(shù)。

在ELISA中，抗原濃度(C_antigen)與酶標抗體濃度(即酶濃度C_enzyme)成正比，即存在：C_antigen∝C_enzyme；在酶催化中，底物濃度遠大于酶催化能力；因此，在給定時間內(nèi)產(chǎn)物濃度(C_prodcut)與酶濃度成正比關(guān)系，即存在：C_product∝C_enzyme；結(jié)合兩個公式，可得：C_antigen∝C_product。出于穩(wěn)妥考慮，采用二階方程表示C_antigen和C_product之間關(guān)系：其中：e、f和g為常數(shù)。

結(jié)合上述公式，可得：其中：h、k和i均為常數(shù)，由于MRB‐ET檢測采用相同的電泳時間，則t₁同樣可視為常數(shù)。

所述的標注濃度標尺是指按照校正后的公式對電泳通道上的所有刻度一一進行標注。

步驟4、在與標準樣品相同條件下通過ELISA‐MRB‐ET檢測樣品中的抗原濃度，電泳結(jié)束時，MRB的停留位置所對應(yīng)的濃度刻度即為樣品中待測抗原濃度。

所述的MRB還包括：移動絡(luò)合界面、移動氧化還原界面、移動沉淀界面和移動親和界面。

所述的樣品通過對金黃葡萄球菌污染的牛奶進行培養(yǎng)，10000r/min離心15min取上清獲得。

所述的SEB型腸毒素為金黃葡萄糖球菌腸毒素的一種，金黃葡萄糖球菌腸毒素是引起食物中毒的致病因子之一，占細菌性食物中毒的第二位。

本實施例采用SEB雙克隆抗體免疫檢測。

實施例2

本實施例的標準樣品為糖化血紅蛋白，采用雙抗體夾心法測定人全血中的HbA1C。

本實施例的一抗為10mg/L、200μL的觸珠蛋白，在4℃的條件包被陰極室過夜，并用磷酸緩沖液清洗3次。

本實施例的封閉是指：使用200μL、3％的BSA封閉板上的空白位點，并在37℃的條件下孵育1h，用磷酸緩沖溶液清洗3次，除去多余液體。

與實施例1相比的區(qū)別在于：本實施例的標準樣品的倍比稀釋濃度分別為5μg/L、2.5μg/L、1.5μg/L、0.625μg/L、0.3125μg/L和0μg/L。

所述的糖化血紅蛋白可反映患者近8～12周的血糖控制情況，是糖尿病診斷新標準和治療監(jiān)測的”金標準”。

實施例3

本實施例的標準樣品為生菜上殘留的硫磷。

所述的硫磷為一種廣譜殺蟲劑，我國要求農(nóng)產(chǎn)品的最大殘留量應(yīng)小于0.1mg/kg，而蔬菜和水果上不得檢出。

本實施例的一抗為羊抗兔抗體，按2000倍數(shù)稀釋，在200μL和4℃的條件下包被陰極室過夜，并用磷酸緩沖液清洗3次。

與實施例1相比的區(qū)別在于：本實施例的硫磷標準樣品的稀釋濃度分別為500ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.5ng/mL和0ng/mL。

本實施例的酶聯(lián)免疫吸附的實驗條件為：10μL的標準樣品，45mL的酶標物和45mL的抗體在陰極室內(nèi)37℃孵育30min，用磷酸緩液清洗3次。

本實施例檢測的樣品通過以下方法獲得：取2g的生菜樣品，剪碎后用5mL的甲醇提取過夜，4000r/min離心20min，取上清，用氮氣吹干后用含10％的甲醇的磷酸鹽緩沖液重新溶解。