本發(fā)明屬于生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種登革病毒IgM/IgG抗體檢測試紙的制備方法。
背景技術(shù)：
登革熱是由1～4型登革病毒引起、經(jīng)伊蚊傳播的急性傳染病，按照《中華人民共和國傳染病防治法》的規(guī)定為乙類傳染病。亞洲、大洋洲、美洲和非洲均有本病發(fā)生，是熱帶、亞熱帶地區(qū)的一個非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。
目前，世界上約有25億人受到登革病毒感染的威脅，每年發(fā)生登革病毒感染患者超過1億人，并且有50萬人發(fā)展成為登革出血熱或登革休克綜合征，造成大約25000人死亡。在我國，20世紀(jì)初本病就已經(jīng)傳入我國，20世紀(jì)20年代和40年代曾造成上海、杭州、廣州、漢口等地的廣泛流行。1978年5月本病在廣東省佛山市發(fā)生流行，以后的十年中，疫情迅速在廣東、廣西、海南省流行。20世紀(jì)80年代云南邊境局部地區(qū)曾發(fā)生過登革熱散發(fā)流行，并從白紋伊蚊分離到登革病毒4型。20世紀(jì)90年代以來，本病主要在廣東、福建流行，多為小規(guī)模流行或散發(fā)。1999年和2004年因輸入性病例導(dǎo)致福建和浙江等地發(fā)生暴發(fā)流行，其它省區(qū)近年來也常有輸入性病例的發(fā)生。但是，由于登革熱傳播迅猛、發(fā)病率高，特別是近些年由于人員流動頻繁和國際旅游的迅猛發(fā)展，使登革病毒的流行范圍及其傳播媒介埃及伊蚊和白紋伊蚊的分布范圍也在相應(yīng)擴(kuò)大。登革病毒有四個血清型，在一個地區(qū)往往存在不同血清型病毒的交替流行，這更增加了登革出血熱和登革休克綜合征發(fā)生的可能性。登革出血熱和登革休克綜合征的病死率較高，不僅嚴(yán)重影響人民的身體健康，而且嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)、貿(mào)易和旅游事業(yè)的發(fā)展，故早期診斷極為重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種登革病毒IgM/IgG抗體檢測試紙的制備方法，該制備方法得到的檢測試紙?jiān)\斷快速且結(jié)果準(zhǔn)確。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是：提供一種登革病毒IgM/IgG抗體檢測試紙的制備方法，包括步驟為：
（1）將三羥甲基氨基甲烷、蔗糖、海藻糖和牛血清白蛋白溶于水并定容，調(diào)節(jié)pH值至8-9，得到重懸液，將海藻糖溶于pH值為7-8的磷酸鹽緩沖溶液中得到包被基液；
（2）膠體金中加入碳酸鉀后調(diào)節(jié)pH，再依次加入登革病毒抗原、牛血清白蛋白溶液，離心得到第一沉淀，所述第一沉淀用步驟（1）得到的重懸液重懸得到登革病毒抗原免疫金；膠體金中加入碳酸鉀后調(diào)節(jié)pH，再依次加入鼠IgG、牛血清白蛋白溶液，離心得到第二沉淀，所述第二沉淀用步驟（1）得到的重懸液重懸得到鼠IgG免疫金；
（3）往登革病毒抗原免疫金中加入鼠IgG免疫金，再用步驟（1）得到的重懸液重懸，得到登革病毒IgM/IgG抗體檢測免疫金；
（4）用步驟（1）得到的包被基液和無水乙醇稀釋抗人IgM抗體得到抗人IgM抗體檢測線包被液；用步驟（1）得到的包被基液和無水乙醇稀釋抗人IgG抗體得到抗人IgG抗體檢測線包被液；用步驟（1）得到的包被基液和無水乙醇稀釋羊抗鼠IgG多抗得到對照線包被液；
（5）用步驟（3）得到的所述登革病毒IgM/IgG抗體檢測免疫金對金墊噴金得到免疫金墊，用步驟（4）得到的所述抗人IgM抗體檢測線包被液、所述抗人IgG抗體檢測線包被液、對照線包被液分別在硝酸纖維素膜上劃線，得到反應(yīng)膜；
（6）將步驟（5）得到的反應(yīng)膜放置，再放入膜封閉液中浸泡后取出瀝干粘貼于聚氯乙烯底板上干燥得到貼膜的聚氯乙烯底板，其中膜封閉液是將聚乙二醇20000、三羥甲基氨基甲烷、曲拉通100溶于水中得到；
（7）將樣品墊、免疫金墊、貼膜的聚氯乙烯底板和吸水紙組裝在一起得到登革病毒IgM/IgG抗體檢測試紙。
在本發(fā)明一個較佳實(shí)施例中，步驟（1）中所述三羥甲基氨基甲烷、所述蔗糖、所述海藻糖、所述牛血清白蛋白、所述定容后的總體積的比例為0.24g：10g：5g：1g：100mL。
在本發(fā)明一個較佳實(shí)施例中，步驟（1）中所述重懸液的pH值采用1M鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.4；所述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4；所述磷酸鹽緩沖溶液為0.01M。
在本發(fā)明一個較佳實(shí)施例中，步驟（2）的具體步驟是：往攪拌的膠體金中加入0.2M碳酸鉀，調(diào)節(jié)pH并攪拌10min，加入登革病毒抗原或鼠IgG并攪拌15min，再加入10%牛血清白蛋白溶液，攪拌15min，在4℃、轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心20分鐘得到第一沉淀或第二沉淀，所述第一沉淀或第二沉淀用所述重懸液重懸至離心前總體積的1/20，其中攪拌過程是置于磁力攪拌器上實(shí)現(xiàn)的。
在本發(fā)明一個較佳實(shí)施例中，步驟（2）中所述碳酸鉀為0.2M，所述0.2M碳酸鉀和所述登革病毒抗原的比例為8uL/mL:4μg/mL，所述0.2M碳酸鉀和所述鼠IgG的比例為6uL/mL:11μg/mL；所述10%牛血清白蛋白溶液的加入體積為所述膠體金體積的1/10。
在本發(fā)明一個較佳實(shí)施例中，步驟（3）中所述鼠IgG免疫金的加入體積為所述登革病毒抗原免疫金體積的14%；所述重懸液的體積為步驟（2）中標(biāo)記登革病毒抗原時使用的膠體金體積的1/10減去步驟（3）中登革病毒抗原免疫金體積和鼠IgG免疫金體積。
在本發(fā)明一個較佳實(shí)施例中，步驟（4）中所述抗人IgM抗體檢測線包被液中所述抗人IgM抗體的濃度為0.15mg/mL；所述抗人IgG抗體檢測線包被液中所述抗人IgG抗體的濃度為0.5mg/mL；所述對照線包被液中所述羊抗鼠IgG多抗的濃度為1.0mg/mL；所述無水乙醇的加入體積為所述抗人IgM抗體檢測線包被液、所述抗人IgG抗體檢測線包被液或所述對照線包被液總體積的2.5%。
在本發(fā)明一個較佳實(shí)施例中，步驟（5）中所述噴金過程通過點(diǎn)膜噴金設(shè)備實(shí)現(xiàn)；所述金墊采用玻璃纖維膜。
在本發(fā)明一個較佳實(shí)施例中，步驟（6）中所述反應(yīng)膜的放置是在2-8℃下放置4h；所述浸泡時間為30min；所述膜封閉液是將比例為2g：1.21g：0.1mL的聚乙二醇20000、三羥甲基氨基甲烷、曲拉通100溶于水中并定容至100 mL，再稀釋10倍后用于浸泡所述反應(yīng)膜；所述膜封閉液的pH值調(diào)節(jié)至8.0。
在本發(fā)明一個較佳實(shí)施例中，步驟（7）中所述樣品墊采用玻璃纖維膜，在使用前用樣品墊處理液對所述樣品墊浸泡10min后干燥，其中所述樣品墊處理液是將比例為0.1g：1.21g：0.5mL：10mg的酪蛋白、三羥甲基氨基甲烷、吐溫80和鼠抗人紅細(xì)胞抗體溶于水中定容至100 mL，pH值調(diào)節(jié)至8.0；所述登革病毒IgM/IgG抗體檢測試紙是組裝后切割得到的。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的登革病毒IgM/IgG抗體檢測試紙的制備方法，得到的檢測試紙基于免疫側(cè)向流層析技術(shù)，不需任何儀器設(shè)備，能夠通過手工操作、肉眼讀取判斷血液樣本中是否含有登革病毒IgM/IgG抗體，診斷快速且結(jié)果準(zhǔn)確，不會對受檢者身體造成傷害。所述試紙采用一份樣本即能對IgM/IgG抗體同時檢測，協(xié)助臨床診斷人體是否受到登革病毒的感染，盡早隔離并治療，對登革熱疾病診斷治療和疫情防控起到非常重大的作用。
具體實(shí)施方式
下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
（一）容器及材料
容器設(shè)備：燒杯、量筒、容量瓶、玻璃棒、磁力攪拌機(jī)、電子天平、移液槍、點(diǎn)膜噴金設(shè)備、裁切機(jī)、切條機(jī)、封口機(jī)、壓殼機(jī)、pH計(jì)、鼓風(fēng)干燥箱。
試劑輔料：氯金酸、檸檬酸三鈉、K2CO3、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、無水乙醇、Tris（三羥甲基氨基甲烷）、HCl、BSA（牛血清白蛋白）、PEG20000（聚乙二醇20000）、TritonX-100（曲拉通）、酪蛋白、Tween-80（吐溫80）、蔗糖、海藻糖、鼠抗人紅細(xì)胞抗體。
物料：玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、聚氯乙烯底板、吸水紙、塑料卡、干燥劑、一次性滴管、鋁箔袋。
環(huán)境：潔凈、室溫、干區(qū)相對濕度≤30%，濕區(qū)相對濕度45-65%，水質(zhì)：高純水。
（二）制備過程
1、膠體金的制備：采用檸檬酸三鈉還原法
50 mL 2%氯金酸溶液配制：取1g/瓶的氯金酸溶于高純水中，容量瓶定容至50 mL，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
100 mL 5%檸檬酸三鈉溶液配制：稱取5.00g檸檬酸三鈉溶于高純水中，容量瓶定容至100 mL，用0.22 μm濾頭過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。
膠體金制備方法：在潔凈燒杯中加入高純水，于磁力攪拌器上加熱至煮沸，然后加入5%檸檬酸三鈉溶液，充分混勻2min，加入2%氯金酸溶液，維持加熱30min，冷卻后加高純水稀釋，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
各組份加入體積：
2、樣品墊的預(yù)處理：
1L樣品墊處理液配制：稱取1g酪蛋白、12.1g Tris和0.1g鼠抗人紅細(xì)胞抗體，量取5mL Tween-80溶于高純水中，容量瓶定容至1L，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
將型號為RB65的玻璃纖維膜在樣品墊處理液中浸潤，浸泡10min，取出于相對濕度≤30%風(fēng)干1h，裁去邊緣防止邊緣效應(yīng)，裝入鋁箔袋中室溫保存?zhèn)溆谩?/p>
3、重懸液、包被基液、膜封閉液溶液配制
100mL 1M鹽酸配制：量取8.59 mL濃鹽酸溶于高純水中，容量瓶定容至100 mL，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>
100mL重懸液配制：稱取0.24g Tris、10g蔗糖、5g海藻糖和1g BSA溶于高純水，在100mL容量瓶中定容，用1M鹽酸調(diào)pH為8.4，用0.22μm濾頭過濾，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
磷酸鹽緩沖液（PBS）配制：稱取2.84g磷酸氫二鈉溶于高純水，容量瓶定容至100 mL，即為0.2M磷酸氫二鈉溶液；稱取2.40g磷酸二氫鈉溶于高純水，容量瓶定容至100 mL，即為0.2M磷酸二氫鈉溶液；用0.22 μm濾頭過濾，2-8℃保存?zhèn)溆谩Ａ咳?9 mL0.2M磷酸二氫鈉溶液，81 mL0.2M磷酸氫二鈉溶液，稱取17.00g氯化鈉，加入1900 mL高純水，混勻，即為0.01M，pH=7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS），2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
包被基液配制：稱取1.00 g海藻糖溶于磷酸鹽緩沖液（PBS），容量瓶定容至100 mL，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
膜封閉液配制：稱取2.00g PEG20000和1.21g Tris，量取0.1 mL TritonX-100溶于高純水，在100mL容量瓶中定容，用1M鹽酸調(diào)pH為8.0，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
4、免疫金標(biāo)記
100mL 0.2 M碳酸鉀溶液配制：稱取2.76 g碳酸鉀溶于高純水，容量瓶定容至100mL，用0.22 μm濾頭過濾，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
100mL 10％BSA溶液配制：稱取10 g BSA溶于高純水中，容量瓶定容至100mL，0.22 μm濾頭過濾，2-8℃密閉保存?zhèn)溆谩?/p>
標(biāo)記登革病毒抗原：取燒杯，加入膠體金，置磁力攪拌機(jī)上攪拌，加入8uL/mL的0.2M碳酸鉀，調(diào)節(jié)pH并攪拌10min，緩慢加入4μg/mL的登革病毒抗原，攪拌15min，緩慢加入10% BSA保護(hù)劑，至終濃度1%，攪拌15min，在4℃下轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心20min，棄去上清液，沉淀用重懸液重懸至原體積的1/20，得到登革病毒抗原免疫金，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
標(biāo)記鼠IgG：取燒杯，加入膠體金，置磁力攪拌機(jī)上攪拌，加入6uL/mL的0.2M碳酸鉀，調(diào)節(jié)pH并攪拌10min，緩慢加入11μg/mL 的鼠IgG，攪拌15 min，緩慢加入10% BSA保護(hù)劑，至終濃度1%，攪拌15min，在4℃下轉(zhuǎn)速為10000 r/min的條件下離心20min，棄去上清液，沉淀用重懸液重懸至原體積的1/20，得到鼠IgG免疫金，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
登革病毒IgM/IgG抗體檢測免疫金制備：往登革病毒抗原免疫金中按其體積的14%加入鼠IgG免疫金，再用重懸液重懸至標(biāo)記登革病毒抗原時使用的膠體金體積的1/10，得到登革病毒IgM/IgG抗體檢測免疫金，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
5、點(diǎn)膜噴金操作
噴金：打開點(diǎn)膜噴金設(shè)備，將噴金模塊壓下去，劃線模塊抬上來，防止劃線頭碰觸到板面，打開真空泵至0.5個大氣壓。
按[運(yùn)行]進(jìn)入運(yùn)行畫面，選擇[程序]轉(zhuǎn)換到噴金工作模式。進(jìn)入程序數(shù)據(jù)畫面后選擇好程序號，編輯好“長度”、“濃度”、“速度”、“原點(diǎn)X、Y、Z”等參數(shù)，修改好參數(shù)后，按[保存]保存數(shù)據(jù)，按[永久保存]將永久保存數(shù)據(jù)。
按[手動]進(jìn)入手動畫面，將2號泵（噴金模式）樣品管道插入高純水試管中，管道末端準(zhǔn)備接水的器皿。選擇[清洗]使用高純水清洗5遍。待拿走高純水試管后，選擇[排液]直至管道內(nèi)無水分。此時將2號泵樣品管道插入試管中，按[加液]直至管道內(nèi)充滿登革病毒IgM/IgG抗體檢測免疫金。將金墊放在板面上的合適位置，按[運(yùn)行]進(jìn)入運(yùn)行畫面，按[開始]進(jìn)行噴金。
噴金完畢，將2號泵樣品管道插入高純水試管中，管道末端準(zhǔn)備接水的器皿。選擇[清洗]使用高純水清洗5遍。按[主菜單]的[氣操作]開氣至氣壓為零。
噴金處理后的金墊于相對濕度≤30%風(fēng)干1h。干燥處理后的免疫金墊置于鋁箔袋中，加干燥劑室溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>
配制檢測線包被液：用包被基液、無水乙醇稀釋抗人IgM抗體至終濃度為0.15mg/mL，得到檢測線包被液即T線(M)工作液；用包被基液、無水乙醇稀釋抗人IgG抗體至終濃度為0.5mg/mL，得到檢測線包被液即T線(G)工作液，分別將兩種T線工作液2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
配制對照線包被液：用包被基液、無水乙醇將羊抗鼠IgG多抗稀釋至終濃度為1.0mg/mL，得到對照線包被液即C線工作液，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>
點(diǎn)膜：將劃線模塊壓下去，將噴金模塊抬上來，形成一定的落差，防止噴金頭觸碰板面。
按[運(yùn)行]進(jìn)入運(yùn)行畫面，選擇[程序]轉(zhuǎn)換到劃線工作模式。進(jìn)入程序數(shù)據(jù)畫面后選擇好程序號，編輯好“長度”、“濃度”、“速度”、“原點(diǎn)X、Y、Z”等參數(shù)，其中“速度”不可太快，為80mm/s，修改好參數(shù)后，按[保存]保存數(shù)據(jù)，按[永久保存]將永久保存數(shù)據(jù)。
按[手動]進(jìn)入手動畫面，將1、3號泵（劃線模式）樣品管道插入高純水試管中，管道末端準(zhǔn)備接水的器皿。選擇[清洗]使用高純水清洗5遍。待拿走高純水試管后，選擇[排液]直至管道內(nèi)無水分。此時將1號泵（劃線模式）樣品管道插入C線工作液中，將3號泵（劃線模式）樣品管道插入T線(M)工作液中，按[加液]直至管道內(nèi)充滿包被液。將準(zhǔn)備好的硝酸纖維素膜放在板面上的合適位置，按[運(yùn)行]進(jìn)入運(yùn)行畫面，按[開始]進(jìn)行劃線。
劃線操作完畢，將1、3號泵樣品管道插入高純水試管中，管道末端準(zhǔn)備接水的器皿。選擇[清洗]使用高純水清洗5遍。待拿走高純水試管后，選擇[排液]直至管道內(nèi)無水分。關(guān)閉1號泵。將3號泵（劃線模式）樣品管道插入T線(G)工作液中，按[加液]直至管道內(nèi)充滿包被液。將準(zhǔn)備好的硝酸纖維素膜放在板面上的合適位置，按[運(yùn)行]進(jìn)入運(yùn)行畫面，按[開始]進(jìn)行劃線。劃線操作完畢，將3號泵樣品管道插入高純水試管中，管道末端準(zhǔn)備接水的器皿。選擇[清洗]使用高純水清洗5遍。關(guān)閉點(diǎn)膜噴金儀。劃線完成后的硝酸纖維素膜即反應(yīng)膜于2-8℃保存，4h后備用。
將反應(yīng)膜放入10倍稀釋后的膜封閉液中浸泡30min，取出貼于聚氯乙烯底板的相應(yīng)位置，將粘有反應(yīng)膜的聚氯乙烯底板置于干燥箱中，60℃±3℃，相對濕度≤30%，烘干2h至完全干燥。干燥完成后將所述聚氯乙烯底板置于鋁箔袋中，加干燥劑室溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>
6、組裝切割、裝配、包裝
將樣品墊、免疫金墊、粘有反應(yīng)膜的聚氯乙烯底板和吸水紙組裝在一起，使用自動斬切機(jī)切割成4mm試紙條。每張?jiān)嚰垪l裝配至塑料卡中，使用壓殼機(jī)壓緊。加入一個干燥劑、一個一次性滴管后裝入鋁箔袋中保存，即為成品。
所述登革病毒IgM/IgG抗體檢測試紙?jiān)谙跛崂w維素膜的檢測區(qū)固定了抗人IgM抗體、抗人IgG抗體，在對照區(qū)固定了羊抗鼠IgG多抗，在玻璃纖維素膜上預(yù)包被登革病毒抗原和鼠IgG-膠體金。測試時，滴加5uL血清、血漿或全血，再滴加一滴（約50μL）緩沖液（PBS），水平放置。免疫金墊上的登革病毒抗原和鼠IgG-膠體金會溶解，如樣本中含有登革病毒IgM抗體或登革病毒IgG抗體，登革病毒抗原-膠體金與樣本中的登革病毒IgM抗體或登革病毒IgG抗體結(jié)合在一起，形成“抗體-抗原-金”復(fù)合物，復(fù)合物沿著試紙條向后方移動，首先到達(dá)包被了抗人IgM抗體的檢測區(qū)（M），“抗體-抗原-金”復(fù)合物將同抗人IgM抗體結(jié)合，并在檢測線上滯留下來，形成一條紅色的線，這表示陽性結(jié)果。線條顏色的深淺同樣本中的抗體數(shù)量沒有比例關(guān)系。該區(qū)里如果沒有帶顏色的線條表示樣本中不含登革病毒IgM抗體或登革病毒IgM抗體低于本試紙最低檢出限，游離的“抗體-抗原-金”復(fù)合物繼續(xù)向試紙后方移動，到達(dá)包被了抗人IgG抗體的檢測區(qū)（G），抗體-抗原-金”復(fù)合物將同抗人IgG抗體結(jié)合，并在檢測線上滯留下來，形成一條紅色的線，這表示陽性結(jié)果。線條顏色的深淺同樣本中的抗體數(shù)量沒有比例關(guān)系。該區(qū)里如果沒有帶顏色的線條表示樣本中不含登革病毒IgG抗體或登革病毒IgG抗體濃度低于本試紙最低檢出限。復(fù)合物繼續(xù)移動，游離的“鼠IgG-金”復(fù)合物會同羊抗鼠IgG結(jié)合在一起而富集在對照區(qū)，形成一條紅色的線。對照線的出現(xiàn)證明試紙條檢測功能正常。無論樣本中是否含有登革病毒IgM抗體或登革病毒IgG抗體，在有效試驗(yàn)中，試紙條的對照區(qū)都應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)淡紅至紫紅色的對照線。樣本繼續(xù)移動，通過對照區(qū)進(jìn)入吸收區(qū)。吸收區(qū)的作用是吸附剩余的復(fù)合物，使其在試紙條內(nèi)移動，并消除本底的顏色。自試紙條加入稀釋后的樣本混合液起計(jì)時，15~20分鐘內(nèi)方可讀取結(jié)果。
以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。