本發(fā)明涉及一種基于絲網(wǎng)印刷電極檢測抗生素殘留的比率型適配體傳感器的制備方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品安全檢測技術領域。

背景技術：

抗生素是一種能抑制或殺死其他微生物細胞的生理活性物質，主要由微生物產(chǎn)生。自20世紀30年代發(fā)現(xiàn)青霉素以來，現(xiàn)如今已被發(fā)現(xiàn)的抗生素有2000多種。常在奶牛中使用的抗生素主要有氨基糖苷類、β-內酰胺類、四環(huán)素類和大環(huán)內酯類等。 如果人類長期食用含抗生素殘留的動物性食品后，藥物不斷在體內蓄積，會對人體產(chǎn)生毒性作用，增加細菌的耐藥性，引起人體的過敏和變態(tài)反應，甚至會產(chǎn)生致癌、致畸、致突變作用。雖然近年來國際上嚴格限制抗生素的殘留最大量，但由于其對某些作物具有生長刺激作用，所以仍有不少違章使用現(xiàn)象，因此實現(xiàn)對抗生素的檢測是至關重要的。

普通的三電極系統(tǒng)不便于攜帶，傳統(tǒng)電極上生物識別過程引起的阻抗變化非常小，其電極表面的半無限線性擴散層易使反應物損耗；微陣列電極雖然可以將反應過程中發(fā)生的阻抗變化放大，但其易被磨損，造成再次利用時的偏差。相比傳統(tǒng)電極，絲網(wǎng)印刷電極輕巧，攜帶方便，可一次性使用，對于現(xiàn)場檢測具有很好的優(yōu)勢，因此絲網(wǎng)印刷電極與傳統(tǒng)的檢測系統(tǒng)相結合成為具有潛力的選擇。傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測方法具有選擇性好、靈敏度高和準確度高，同時檢測多種元素或化合物的優(yōu)勢，但其需要昂貴的儀器設備,樣品的前處理過程繁瑣、費時，并且對分析人員的技術水平要求很高，不適于現(xiàn)場快速檢測。因此本文嘗試制備一種基于兩種探針的檢測抗生素殘留的比率型適配體傳感器。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能克服上述方法的缺陷，且靈敏度高、特異性高、集成化、便攜化的抗生素素殘留檢測的比率型適配體傳感器檢測方法。采用的技術方案為：利用絲網(wǎng)印刷電極的集成化、便攜化，利用二茂鐵,即Fc、納米碳纖維即NCFs兩種探針分別構建相應的適配體傳感器，在兩種基礎傳感器的基礎上構建比率型傳感器，以達到靈敏度高、精確度高、減小批次間差異的檢測目的。通過抗原與適配體間的特異性反應，檢測電極表面的電流值變化，研究該傳感器的電化學性能。

所述基于絲網(wǎng)印刷電極檢測抗生素殘留的比率型適配體傳感器的制備方法的步驟如下 ：

1）納米金/納米金-殼聚糖復合物、納米碳纖維、二茂鐵-適配體的制備；

2）清洗活化絲網(wǎng)印刷電極，得到預處理的絲網(wǎng)印刷電極；

3）將步驟1）制備得到的納米金-殼聚糖復合物和納米碳纖維/納米金分別修飾到步驟2）預處理的絲網(wǎng)印刷電極上，得到修飾好的絲網(wǎng)印刷電極；

4) 將二茂鐵-適配體、適配體分別滴加到步驟3）所得的修飾好的絲網(wǎng)印刷電極上，自然晾干后得到基于絲網(wǎng)印刷電極的基礎適配體傳感器；

5）優(yōu)化步驟4）所得的基礎適配體傳感器的三種試驗條件；

6）在步驟5）所得的最優(yōu)條件下，對四環(huán)素等抗生素進行檢測。

所述基于絲網(wǎng)印刷電極檢測抗生素殘留的比率型適配體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟1）所述納米金-殼聚糖復合物、納米碳纖維、二茂鐵-適配體分別是以殼聚糖為分散劑分散納米金，取一定濃度的納米碳纖維溶液，將二茂鐵與適配體混合得到分散均勻的懸濁液。

所述基于絲網(wǎng)印刷電極檢測抗生素殘留的比率型適配體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟3）所述絲網(wǎng)印刷電極電極的修飾，是分別先將7 μL納米金-殼聚糖復合物、30% 納米碳纖維溶液和納米金溶液滴加到預處理的絲網(wǎng)印刷電極上，室溫下晾干，分別得到納米金-殼聚糖，納米碳纖維/納米金修飾的絲網(wǎng)印刷電極。

所述基于絲網(wǎng)印刷電極檢測抗生素殘留的比率型適配體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟4）所述在修飾好的電極上分別滴加7 μL 二茂鐵-適配體復合物、適配體溶液，是將7 μL 二茂鐵-適配體復合物滴加到納米金-殼聚糖修飾好的絲網(wǎng)印刷電極上，將7 μL 適配體溶液滴加到納米碳纖維/納米金修飾的絲網(wǎng)印刷電極上，在4℃條件下干燥，得到兩種適配體生物傳感器。

所述基于絲網(wǎng)印刷電極檢測抗生素殘留的比率型適配體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟5）所述兩種適配體生物傳感器的三種試驗條件測試底液pH值、適配體濃度、孵育時間分別進行了優(yōu)化：pH值為7.0，適配體濃度為6 μM，孵育時間為60 min。

所述基于絲網(wǎng)印刷電極檢測抗生素殘留的比率型適配體傳感器的制備方法，其特征在于，步驟6）所述滴加不同濃度的四環(huán)素標準液，孵育 60 min，在底液中進行循環(huán)伏安法檢測。

所述基于絲網(wǎng)印刷電極檢測抗生素殘留的比率型適配體傳感器的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：

1） 納米金/納米金-殼聚糖復合物、納米碳纖維、二茂鐵-適配體的制備：100 mL 質量體積比為0.01%的氯金酸滴加到燒杯中，置于電爐上加熱，邊加熱邊攪拌直至沸騰，然后迅速加入2.5 mL 1%檸檬酸鈉溶液，隨著反應的進行該溶液很快變成了紅寶石顏色，說明指示的金納米粒子的形成；劇烈攪拌該溶液持續(xù)1小時后，得到所制備的納米金溶液；稱取0.5 g殼聚糖置于燒杯中，加入1.0 %的醋酸溶液攪拌溶解，將溶解好的溶液置于250 mL容量瓶中并定容，定容后的溶液倒入燒杯中，在磁力攪拌器下磁力攪拌10 h，得到0.2%的殼聚糖溶液；將20 mL 1％的殼聚糖乙酸溶液攪拌加入到上述納米金溶液中得到納米金-殼聚糖復合物；1 g二茂鐵加入到100 mL 乙醇溶液中超聲30 min，得到 1%二茂鐵溶液，然后將適配體溶液加入到二茂鐵溶液中，在4 ℃下攪拌混勻12小時，得到二茂鐵-適配體復合物；

2）絲網(wǎng)印刷電極的清洗、活化：首先，將絲網(wǎng)印刷碳電極放入盛有1mM 氫氧化鈉溶液的小燒杯中超聲清洗5分鐘，超純水清洗，氮氣吹干，然后，將電極放入盛有1mM 鹽酸溶液的小燒杯中超聲清洗5分鐘，超純水清洗，氮氣吹干，之后用無水乙醇清洗電極，氮氣吹干，最后，在pH 5.0的磷酸鹽緩沖液中進行電流-時間曲線掃描300s，之后，進行循環(huán)伏安曲線掃描，直至性能穩(wěn)定；

3）絲網(wǎng)印刷電極的修飾：在絲網(wǎng)印刷電極上分別滴加7 μL 納米金-殼聚糖復合物、30% 納米碳纖維溶液和納米金溶液滴加到預處理的絲網(wǎng)印刷電極上，室溫下晾干，分別得到納米金-殼聚糖，納米碳纖維/納米金修飾的絲網(wǎng)印刷電極；

4）適配體的固定：在上述的電極上滴加7 μL二茂鐵-適配體復合物滴加到納米金-殼聚糖修飾好的絲網(wǎng)印刷電極上，將7 μL 適配體溶液滴加到納米碳纖維/納米金修飾的絲網(wǎng)印刷電極上，在室溫下干燥，得到兩種適配體生物傳感器，并將制備好的電極放于4 ℃干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?/p>

5）試驗條件的優(yōu)化：制備一系列pH值的磷酸鹽緩沖液，pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，并分別配成了一系列的檢測底液，在這些底液中對傳感器電流值進行檢測，篩選出最佳pH值7.0；分別向電極負載2 μM、4 μM、5 μM、6 μM、8 μM的適配體，對其電流值進行檢測，篩選出最佳適配體濃度為6 μM；用同一濃度的四環(huán)素孵育時間分別控制為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，對其電流值進行檢測，篩選出最佳孵育時間為60 min；

6）四環(huán)素的檢測：在最優(yōu)條件下：pH 7.0，適配體濃度 6 μM，孵育時間60 min，在兩種適配體傳感器上對不同濃度的四環(huán)素進行電流檢測，并分別建立了建立不同四環(huán)素濃度與絲網(wǎng)印刷電極電流變化之間的關系曲線，進而得到不同濃度的四環(huán)素的對數(shù)值與電流峰值比率之間的線性回歸方程，在濃度范圍10^-11～10^-9g/mL內得到y(tǒng)=-0.02854x - 0.02655，相關系數(shù)為 0.994；在濃度范圍10^-9～10^-3g/mL內得到y(tǒng) = -0.00225x + 0.20538，相關系數(shù)0.997。

所述基于絲網(wǎng)印刷電極檢測抗生素殘留的比率型適配體傳感器的制備方法，其特征在于，牛奶中四環(huán)素等抗生素殘留具體檢測步驟如下：

1）牛奶樣品的前處理：在當?shù)爻匈徺I牛奶，把牛奶按照1:10的比例進行稀釋，然后分裝到離心管中，以20000轉/秒的速度離心90min；離心結束后，牛奶分為明顯的三層，上、下層是脂肪和酪蛋白等大分子物質，為了避免大分子物質對抗生素的包裹，我們去中間一層的乳清，搜集乳清，向搜集好的乳清中添加四環(huán)素等抗生素，濃度分別是5×10^-10 g/mL，5×10^-9g/mL，5×10^-8g/mL，5×10^-7g/mL；

2）樣品的檢測：在最優(yōu)條件下：pH 7.0，適配體濃度 6μM ，孵育時間60 min，對牛奶樣品進行檢測；

3）根據(jù)建立的相應的線性關系，計算出相應樣品的四環(huán)素等抗生素殘留量。

所述基于絲網(wǎng)印刷電極檢測抗生素殘留的比率型適配體傳感器的制備方法，其特征在于，用于檢測四環(huán)素等抗生素殘留。

所述基于絲網(wǎng)印刷電極檢測抗生素殘留的比率型適配體傳感器的制備方法，其特征在于，所用電極為絲網(wǎng)印刷電極，包括一印制電極的基片、基片上印制的外部絕緣層和三根電極引線，其特征在于所述的基片上還印制有三個電極，一個工作電極：碳電極；一個對電極：碳電極，直徑3mm；和一個參比電極：Ag/AgCl電極，各電極對應連接有一電極引線，該電極電化學性能穩(wěn)定，均一性好,后面的說明中，該絲網(wǎng)印刷電極簡寫為SPCE。

所述方法，其特征在于，采用本發(fā)明制備的基于絲網(wǎng)印刷電極的比率型適配體檢測四環(huán)素的傳感器具有操作簡單、成本低廉、檢測靈敏度高、精確度高、減小批次間差異等優(yōu)點且反應時間短，樣品和試劑消耗量少，穩(wěn)定性高，可用于實際樣品的現(xiàn)場檢測，符合我國四環(huán)素殘留快速檢測技術發(fā)展和國際化要求。

附圖說明

圖1 二茂鐵-適配體、納米碳纖維即NCFs、納米碳纖維-納米金即NCFs-AuNPs復合物的掃描電鏡圖：A.低倍率下二茂鐵-適配體復合物的掃描電鏡圖；B.高倍率下二茂鐵-適配體復合物的掃描電鏡圖；C. 納米碳纖維的掃描電鏡圖；D. 納米碳纖維-納米金的掃描電鏡圖；

圖2 納米金-殼聚糖/二茂鐵-適配體/牛血清白蛋白/四環(huán)素傳感器組裝過程中含0.1 mol/L KCl和5 mmol/L的鐵氰化鉀的磷酸鹽緩沖液中的循環(huán)伏安表征圖：a）空絲網(wǎng)印刷電極即SPCE；b）納米金-殼聚糖/SPCE；c) 二茂鐵-適配體/納米金-殼聚糖/SPCE；d）牛血清白蛋白/二茂鐵-適配體/納米金-殼聚糖/SPCE；e）四環(huán)素/牛血清白蛋白/二茂鐵-適配體/納米金-殼聚糖/SPCE；

圖3 納米碳纖維/納米金/適配體/牛血清白蛋白/四環(huán)素傳感器組裝過程中含0.1 mol/L KCl和5 mmol/L的鐵氰化鉀的磷酸鹽緩沖液中的循環(huán)伏安表征圖：a）空絲網(wǎng)印刷電極；b）納米碳纖維/SPCE；c) 納米金/納米碳纖維/SPCE；d）適配體/納米金/納米碳纖/SPCE；e）血清白蛋白/適配體/納米金/納米碳纖維/SPCE；f）四環(huán)素/牛血清白蛋白/納米金/納米碳纖維/SPCE；

圖4 底液pH值對傳感器電流響應的影響；

圖5 適配體濃度對傳感器電流響應的影響；

圖6 孵化時間對傳感器電流響應的影響；

圖7 納米金-殼聚糖/二茂鐵-適配體/牛血清白蛋白/四環(huán)素傳感器被不同濃度四環(huán)素孵育后的差分脈沖伏安曲線，四環(huán)素濃度：a-k: a. 0g/mL； b. 10-3g/mL；c.10-4g/mL；d.10-5g/mL；e.10-6g/mL；f.10-7g/mL；g.10-8g/mL；h.10-9g/mL；i.10-10g/mL；j. 10-11g/mL；k. 10-12g/mL；

圖8 納米碳纖維/納米金/適配體/牛血清白蛋白/四環(huán)素傳感器被不同濃度四環(huán)素孵育后的差分脈沖伏安曲線，四環(huán)素濃度：a-j: a.0g/mL；b.10-3g/mL；c.10-4g/mL； d.10-5g/mL；e.10-6g/mL；f.10-7g/mL；g.10-8g/mL；h.10-9g/mL；i.10-10g/mL；j. 10-11g/mL；

圖9 兩種傳感器分別孵育四環(huán)素后的電流變化與四環(huán)素濃度的對數(shù)的線性關系；

圖10 兩種傳感器分別孵育四環(huán)素后的電流變化比率與四環(huán)素濃度的對數(shù)的線性關系；

圖11 該比率型適配體傳感器對實際樣品中抗生素加標回收率的檢測。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。

實施例 1 一種基于絲網(wǎng)印刷電極比率型適配體傳感器的制備步驟 ：

1） 納米金/納米金-殼聚糖復合物、納米碳纖維、二茂鐵-適配體的制備：100 mL 0.01%的氯金酸滴加到燒杯中，置于電爐上加熱，邊加熱邊攪拌直至沸騰，然后迅速加入2.5 mL 1% 檸檬酸鈉溶液，隨著反應的進行該溶液很快變成了紅寶石顏色，說明指示的金納米粒子的形成；劇烈攪拌該溶液持續(xù)1小時后，得到所制備的納米金溶液；稱取0.5 g殼聚糖即CS置于燒杯中，加入1.0 %的醋酸溶液攪拌溶解，將溶解好的溶液置于250 mL容量瓶中并定容，定容后的溶液倒入燒杯中，在磁力攪拌器下磁力攪拌10 h，得到0.2%的殼聚糖溶液；將20 mL 1％的殼聚糖乙酸溶液攪拌加入到上述納米金溶液中得到納米金-殼聚糖復合物；1 g二茂鐵加入到100 mL乙醇溶液中超聲30 min，得到 1%二茂鐵溶液，然后將適配體溶液加入到二茂鐵溶液中，在4 ℃ 下攪拌混勻12小時，得到二茂鐵-適配體復合物；

2）絲網(wǎng)印刷電極的清洗、活化：首先，將絲網(wǎng)印刷碳電極放入盛有1mM NaOH溶液的小燒杯中超聲清洗5分鐘，超純水清洗，氮氣吹干，然后，將電極放入盛有1mM HCl 溶液的小燒杯中超聲清洗5分鐘，超純水清洗，氮氣吹干，之后，用無水乙醇清洗電極，氮氣吹干，最后，在pH 5.0的磷酸鹽緩沖液中進行電流-時間曲線掃描300s，之后進行循環(huán)伏安曲線掃描，直至性能穩(wěn)定；

3）絲網(wǎng)印刷電極的修飾：在絲網(wǎng)印刷電極上分別滴加7 μL 納米金-殼聚糖復合物、30% 納米碳纖維溶液和納米金溶液滴加到預處理的絲網(wǎng)印刷電極上，室溫下晾干，分別得到納米金-殼聚糖，納米碳纖維/納米金修飾的絲網(wǎng)印刷電極；

4）適配體的固定：在上述的電極上滴加7 μL 二茂鐵-適配體復合物滴加到納米金-殼聚糖修飾好的絲網(wǎng)印刷電極上，將7 μL 適配體溶液滴加到納米碳纖維/納米金修飾的絲網(wǎng)印刷電極上，在室溫下干燥，得到兩種適配體生物傳感器，并將制備好的電極放于4 ℃干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例 2 適配體生物傳感器組裝過程中的電化學表征

1）運用掃描電子顯微鏡對修飾有二茂鐵-適配體、納米碳纖維、納米碳纖維-納米金的絲網(wǎng)印刷電極的微觀結構圖進行表征，如圖1所示，可以看到納米材料成功修飾到電極表面；

2）納米金-殼聚糖/二茂鐵-適配體/牛血清白蛋白/四環(huán)素組裝過程中不同電極在含0.1 mol/L KCl和5 mmol/L的鐵氰化鉀的磷酸鹽緩沖液中的循環(huán)伏安曲線，如圖2所示，圖中曲線a）是空絲網(wǎng)印刷電極的表征圖，我們可以看出明顯的氧化還原峰；如圖中曲線b）所示，當絲網(wǎng)印刷電極上修飾上納米金-殼聚糖納米材料后，由于納米金具有良好的導電性，因此電流比空絲網(wǎng)印刷電極有所增大；如曲線c）所示，在此基礎上又修飾了二茂鐵-適配體后，因為二茂鐵也具有導電性，所以電流再次增大；當固定牛血清白蛋白7 μL后，由于其是大分子蛋白質，它不但不導電，而且還會阻礙界面的電子傳遞，所以電流峰值變小，如曲線d）所示；

3）納米碳纖維/納米金/適配體/牛血清白蛋白/四環(huán)素組裝過程中不同電極在含0.1 mol/L KCl和5 mmol/L的鐵氰化鉀的磷酸鹽緩沖液中的循環(huán)伏安曲線，如圖2所示，圖中曲線a）是空絲網(wǎng)印刷電極的表征圖，我們可以看出明顯的氧化還原峰；如圖中曲線b）所示，當絲網(wǎng)印刷電極上修飾上納米碳纖維納米材料后，由于納米碳纖維具有良好的導電性，因此電流比空絲網(wǎng)印刷電極有所增大；如曲線c）所示，在此基礎上又修飾了納米金后電流再次增大；當固定適配體7 μL后，由于適配體是蛋白質分子，它不但不導電，而且還會阻礙界面的電子傳遞，所以電流峰值變小，如曲線d）所示，這也證明了適配體已經(jīng)成功的固定到電極表面。

實施例3 試驗條件的優(yōu)化

1）pH值的優(yōu)化

測試底液pH值的不同，對適配體的活性有不同的影響，進而會影響傳感器的靈敏度，所以，本實驗制備了一系列pH值的磷酸鹽緩沖液，pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，并分別配成了一系列的檢測底液；圖4顯示的是兩種傳感器在不同pH值底液中適配體與四環(huán)素孵育前后進行的循環(huán)伏安法測定的電流差值的大小。從圖中可以看出，當pH值為7.0時，差值最大，這表明，pH 7.0是該傳感器的最優(yōu)pH值，此時，適配體能夠更好地發(fā)揮活性；

2）適配體濃度的優(yōu)化

為了減少實驗中適配體的浪費，讓適配體傳感器的性能更加優(yōu)越，對適配體傳感器的一些實驗條件進行了優(yōu)化，將修飾好的電極浸入到不同濃度的適配體溶液中，讓適配體固定到電極上，然后用制備好傳感器對相同濃度的四環(huán)素進行檢測，使用差分脈沖伏安的方法測量峰電流的變化。從圖5中可以明顯的看出，ΔI的值隨著適配體濃度的增大不斷地增大。當濃度大于6 μM后，ΔI的值基本保持在穩(wěn)定的狀態(tài)。這個現(xiàn)象表明，本實驗中適配體的濃度取6 μM已經(jīng)足夠覆蓋電極的表面，適配體與四環(huán)素的特異性結合達到飽和。因此，6 μM的適配體為最佳的濃度；

3）孵化時間的優(yōu)化

孵育時間是衡量傳感器性能的一個重要的標準，為了確定最佳的孵育時間，將制備好的適配體傳感器都滴加相同濃度的四環(huán)素，讓其反應不同的時間，并測量不同時間下的ΔI值的變化，如圖6所示，ΔI的值隨著時間的增加不斷地增大，然而，時間大于60 min后ΔI的值不再隨時間變化而變化，而是保持在一個穩(wěn)定的水平，這主要是固定到電極上的適配體捕捉的四環(huán)素已經(jīng)到達了飽和，所以，最佳的孵育時間選擇60 min。

實施例4 所制備的比率型適配體傳感器的應用

1）孵育四環(huán)素后的電流變化比率與四環(huán)素濃度的對數(shù)的線性關系

配置一系列濃度的四環(huán)素標準溶液，在兩種適配體傳感器上對不同濃度的四環(huán)素進行差分脈沖伏安掃描即圖7、圖8，并分別建立了建立不同四環(huán)素濃度與絲網(wǎng)印刷電極電流變化之間的關系曲線即圖9，進而得到不同濃度的四環(huán)素的對數(shù)值與電流變化比率即△I_CNFs/△I_Fc之間的線性回歸方程：在濃度范圍10^-11～10^-9g/mL內得到y(tǒng)=-0.02854x - 0.02655，相關系數(shù)為 0.994；在濃度范圍10^-9～10^-3g/mL內得到y(tǒng) = -0.00225x + 0.20538，相關系數(shù)0.997，即圖10；

2）檢測實際樣品牛奶中的抗生素殘留

在當?shù)爻匈徺I牛奶，把牛奶按照1:10的比例進行稀釋，然后分裝到離心管中，以20000轉/秒的速度離心90min。離心結束后，牛奶分為明顯的三層，上、下層是脂肪和酪蛋白等大分子物質，為了避免大分子物質對四環(huán)素的包裹，我們去中間一層的乳清，搜集乳清，向搜集好的乳清中添加四環(huán)素，濃度分別是5×10^-10 g/mL，5×10^-9g/mL，5×10^-8g/mL，5×10^-7g/mL；在最優(yōu)條件下對牛奶樣品進行檢測，加標樣品中四環(huán)素的濃度根據(jù)校正曲線算出，其回收率可以達到95.98%-104.28%，如圖11所示。

雖然本發(fā)明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可以做各種改動和修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。