本發(fā)明屬于中藥制劑質(zhì)量控制領(lǐng)域，涉及一種安神寶顆粒的多成分含量測定方法。
背景技術(shù)：
：安神寶顆粒補腎益精，養(yǎng)心安神。用于失眠健忘，眩暈耳鳴，腰膝酸軟。是用于治療失眠健忘的草本植物組方中成藥,劑型為顆粒劑。本品精選邢臺地區(qū)的酸棗仁與枸杞、北合歡，組方科學(xué)、配伍合理。本制劑現(xiàn)行的檢測方法為安神寶制劑采用薄層鑒別、正丁醇提取物來進行質(zhì)量控制，已經(jīng)不符合現(xiàn)階段藥品檢驗技術(shù)的發(fā)展。隨著我國藥品生產(chǎn)質(zhì)量控制水平的提高，國家食品藥品監(jiān)督管理局提出“國家藥品標準提高行動計劃”，以全面提升藥品的質(zhì)量控制水平。因此，建立一種能快速、準確、全面控制安神寶顆粒質(zhì)量的方法，實現(xiàn)對它物質(zhì)群的全面控制，具有重要的意義。枸杞的主要化學(xué)成分有枸杞多糖(LBP)、枸杞黃酮、甜菜堿(betaine)、類胡蘿卜素及類胡蘿卜素酯、維生素C、莨菪亭(scopoletin)、多種氨基酸及微量元素K、Na、Ca、Mg、Cu、Fe、Mn、Zn、P等成分[11]。此外，尚從枸杞中分離得到環(huán)肽(Cyclicpeptides)及枸杞素A—D[12]、腦甙脂類[13]等。其中，枸杞多糖為枸杞主要活性成分，具有增強免疫作用；甜菜堿、玉蜀黍黃素及玉蜀黍黃素二棕櫚酸、腦甙脂類對四氯化碳引起的肝損害有保護作用；枸杞素A和B有抑制血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶的活性[1。酸棗仁含生物堿：酸棗仁堿(sanjoinine)A、B、D、E、F、G1、G2、Ia、Ib、K，還含酸棗仁環(huán)肽(sanjoinenine)。還含三萜類：白樺脂酸(betulinicacid)，白樺脂醇(betulin)，美洲茶酸(ceanothicacid)，麥珠子酸(alphitolicacid)，酸棗皂甙(jujuboside)A、B，以及胡蘿卜甙(daucosterol)。又含黃酮類：斯皮諾素(spinosin)，酸棗黃素(zivulgarin)，6”'-芥子酰斯皮諾素(6”'-sinapoylspinosin)，6”'-阿魏酰斯皮諾素(6”'-feruloylspinosin)，6”'-對香豆酰斯皮諾素(6”'-p-coumaroylspinosin)，當藥素(swer-tisin)，6，8-二-C-葡萄糖基芹菜素(viceninⅡ)，芹菜素-6-C-[(6-O-對羥基苯甲酰)-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖甙[apigenin-6-C-[(6-O-p-hydroxybenzoyl)-β-D-glucopyranosyl(1→2)]-β-D-glucopyranoside]等。還含蘇氨酸(threonine)，纈氨酸(valine)，蛋氨酸(methionine)，亮氨酸(leucine)，異亮氨酸(isoleucine)，賴氨酸(lysine)，苯丙氨酸(phenylalanine)等17種氨基酸和鉀、鈉、鈣、鋅、鐵、銅、錳等多種金屬元素。又含阿魏酸(ferulicacid)，維生素C及植物甾醇，環(huán)磷酸腺苷(cyclicadenosine3',5'-monophosphate)等。藤合歡，養(yǎng)心安神；和血止痛。主心悸失眠；健忘多夢；牙痛；筋骨痛；腰腿麻木；跌打傷痛。主要化學(xué)成分為黃酮類化合物，如槲皮素、蘆丁等。藥品檢驗方法的選擇，應(yīng)根據(jù)"準確、靈敏、簡便、快速"的原則，要強調(diào)方法的適用性，并注意吸收國內(nèi)科研成果和國外先進經(jīng)驗；既要考慮當前國內(nèi)實際條件，又要反應(yīng)新技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展，進一步完善和提高檢測水平。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明是為了提供一種安神寶顆粒的多成分含量測定方法。本發(fā)明針對安神寶顆粒現(xiàn)行質(zhì)量標準未進行含量控制，提出了安神寶顆粒同時進行多成分的含量測定，將酸棗仁中具有安神功效的主要成分：酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B，枸杞中具有確切鎮(zhèn)靜功效的成分：東莨菪內(nèi)酯；藤合歡主要成分槲皮素作為含量測定參數(shù)，使安神寶顆粒的質(zhì)量標準更具有整體性、特征性、和穩(wěn)定性，并且對儀器、色譜柱、檢測器、檢測波長、色譜流動相、柱溫進行了反復(fù)研究、優(yōu)化，通過多指標成分的定量控制，能夠綜合反映安神寶顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，提升制劑的質(zhì)量控制水平，保證制劑多批次制劑的質(zhì)量穩(wěn)定一致性。本發(fā)明所述的多成分含量測定方法是在同一色譜條件下，同時對安神寶顆粒中所含的酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素三種化學(xué)成分進行液相色譜含量測定。本發(fā)明所述的多成分含量測定方法由以下步驟組成：一、色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗：色譜柱：AgilentZorboxSBC184.6mm×150mm，5μ柱溫：柱溫35℃檢測：蒸發(fā)光散射檢測器進樣量：10μl流動相梯度洗脫表：流動相：A為甲醇，B為0.5％冰醋酸二、對照品溶液的制備：分別精密稱取酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素對照品適量，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備液；分別精密量取上述對照品儲備液1.0ml置于同一個20ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液。三、供試品溶液的制備：取本品粉末(過四號篩)約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人70％乙醇50ml，稱定重量，加熱回流6小時，放冷，再稱定重量，用70％乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25ml，置燒瓶中，濃縮至約lml，加3mol/L鹽酸溶液l0ml，水浴中加熱水解2小時，立即冷卻，移人分液漏斗中，用水10ml分次洗滌容器，并入分液漏斗中，加氯化鈉2g，用三氯甲烷強力振搖提取5次，每次15m1,合并三氯甲烷液，加無水硫酸鈉2g，攪拌，濾過，容器用少量三氯甲烷洗滌，濾過，濾液合并，70℃以下濃縮至近干，立即加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。四、測定法：按照步驟(1)所述色譜條件測定，即得。本發(fā)明所述的多成分含量測定方法研究是經(jīng)過大量篩選試驗得到的最佳方案，以下試驗研究為本發(fā)明的優(yōu)選過程，色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗：安神寶顆粒配方為酸棗仁、枸杞、藤合歡，其中，酸棗仁中主要成分為酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B，枸杞主要成分為甜菜堿、東莨菪內(nèi)酯，藤合歡主要成分為黃酮類成分，槲皮素、山奈酚等，為了減少試驗操作，提高檢測的效率，我們針對主要成分進行了研究，力圖同時測定上述主要成分。酸棗仁皂苷類成分的化學(xué)研究和含量測定報道較多，歸納起來主要的分析方法有比色法、薄層掃描法和高效液相色譜法，其中以高效液相色譜法測定較為準確，但由于酸棗仁皂苷A和B的紫外吸收很弱，因此，用常規(guī)的HPLC-UV方法雖有文獻報道，但檢測靈敏度很低。反相高效液相色譜——蒸發(fā)光散射檢測法(RP-HPLC-ELSD)是近年來常用的適合于沒有紫外吸收成分的檢測方法，同時對于有紫外吸收的成分同樣可以適用。甜菜堿含量測定有分光光度法、薄層掃描法、非水滴定法和高效液相色譜法等。高效液相色譜法作為一種現(xiàn)代分離分析技術(shù)，已逐漸應(yīng)用于中藥化學(xué)成分的分離分析和含量測定，在植物甜菜堿含量測定方面的應(yīng)用也日益廣泛，但由于甜菜堿結(jié)構(gòu)中無共軛體系，僅能用折射儀檢測或在低紫外吸收波長(190～220nm)測定，條件要求較高，且靈敏度或選擇性均不夠理想。因此，一般采用的高效液相色譜法都是對甜菜堿提取物進行柱前衍生后測定的，此法破壞了甜菜堿提取物的原始成分。Young等[31]報道采用NH2柱未經(jīng)衍生可直接測定北方枸杞甜菜堿的含量，方法快速、簡便東莨菪內(nèi)酯不溶于水，在甲醇中溶解。通用方法是用乙醇提取出東莨菪苷，采用酸水解，再提取東莨菪內(nèi)酯進行檢測，一般檢測波長為298nm。槲皮素的檢測波長大致在256nm，通常采用甲醇提取進行檢測。1、檢測波長的研究確定綜合幾個主要成分的紫外檢測波長各不相同，并且紫外檢測背景干擾比較大，為了更好同時適用多個成分的檢測，我們采用蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)，對紫外吸收沒有要求，適用于大多數(shù)的成分檢測。2、流動相的研究對照品溶液的配制：分別精密稱取酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、甜菜堿、槲皮素對照品適量，加甲醇溶液分別配制成1.0mg/mL的溶液，作為對照品溶液。首先采用以下流動相進行預(yù)實驗，色譜柱：AgilentZorboxSBC184.6mm×150mm，5μ，柱溫35℃，流速1.0ml/min，蒸發(fā)光散射檢測器檢測,結(jié)果如下：①流動相為：0.5％冰醋酸-甲醇(32：68)，分別進樣酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、甜菜堿、槲皮素對照品對照品溶液，檢出酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素，東莨菪內(nèi)酯及槲皮素出峰時間過早無法分離。②流動相為：水-甲醇-乙酸(45:50:5)，分別進樣酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、甜菜堿、槲皮素對照品對照品溶液，檢出酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素，槲皮素出峰時間過早無法分離，棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B出峰時間過長，峰形不符合要求。③流動相為：甲醇-水-冰醋酸(32:68:0.16)，分別進樣酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、甜菜堿、槲皮素對照品對照品溶液，檢出槲皮素、其他峰形不符合要求。根據(jù)以上試驗結(jié)果，同時檢測多成分需要進行梯度洗脫，分離各類成分。3、流動相梯度洗脫研究對照品溶液制備：分別精密稱取酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、甜菜堿、槲皮素對照品適量，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備液；分別精密量取上述對照品儲備液1.0ml置于同一個20ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液。①預(yù)實驗：流動相：A為甲醇，B為0.5％冰醋酸時間流動相A％流動相B％02987496121882152080222377323268423562509010梯度洗脫峰的存在時因為流動相比例在變化過程中有一個臨界比例，達到那個比例的時候流動相的吸收值就會出現(xiàn)較大的變化，干擾樣品的檢測，幾個對照品的出峰均產(chǎn)生干擾。我們嘗試改變梯度斜率來讓它改變位置和峰型。②調(diào)整梯度系統(tǒng)梯度系統(tǒng)改為漸變系統(tǒng)，減少流動相吸收值的突然變化對對照品出峰的干擾。時間流動相A％流動相B％0-52-1098-905-15109015-2510-2090-8025-35208035-4520-3080-7045-5030-3570-6550-709010峰形改善，其中酸棗仁皂苷A、槲皮素峰形良好，酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、甜菜堿出峰時間處于流動相梯度改變區(qū)間，達不到基線分離。繼續(xù)調(diào)整流動相各區(qū)間的梯度。圖2③確定梯度系統(tǒng)時間流動相A％流動相B％0-52-1098-905-15109015-3010-3090-7030-40307040-5030-4570-5550-60455560-809010峰形改善，峰形改善，酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、東莨菪內(nèi)酯、甜菜堿、槲皮素出峰時間均處于流動相配比穩(wěn)定區(qū)間，達到基線分離。圖34、供試品溶液制備研究梯度系統(tǒng)用對照品進行研究，由于樣品中雜質(zhì)眾多，樣品精制方法決定了雜質(zhì)是否對待測成分產(chǎn)生干擾，我們進行了供試品溶液精制方法研究。①精密秤取樣品2g至10ml的容量瓶中，超聲提取20min，放至室溫，用甲醇定容，充分搖勻，過0.45μm的微孔濾膜，作為供試品溶液1。②精密秤取樣品2g于索氏提取器中，加50ml石油醚，水浴加熱提取2小時，棄取石油醚，再用50ml甲醇索氏提取3小時，收集甲醇提取液，回收甲醇并定量轉(zhuǎn)移至10ml的容量瓶中，用甲醇定容，充分搖勻，過0.45μm的微孔濾膜，作為供試品溶液2。③取本品粉末(過四號篩)約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人70％乙醇50ml，稱定重量，加熱回流6小時，放冷，再稱定重量，用70％乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25ml，置燒瓶中，濃縮至約lml，加3mol/L鹽酸溶液l0ml，水浴中加熱水解2小時，立即冷卻，移人分液漏斗中，用水10ml分次洗滌容器，并入分液漏斗中，加氯化鈉2g，用三氯甲烷強力振搖提取5次，每次15m1,合并三氯甲烷液，加無水硫酸鈉2g，攪拌，濾過，容器用少量三氯甲烷洗滌，濾過，濾液合并，70℃以下濃縮至近干，立即加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液3。色譜條件：流動相：流動相：A為甲醇，B為0.5％冰醋酸，流速1ml/min，蒸發(fā)光散射檢測器，進樣量10μl。梯度洗脫：時間流動相A％流動相B％0-52-1098-905-15109015-3010-3090-7030-40307040-5030-4570-5550-60455560-809010結(jié)果：供試品溶液1由于無除雜步驟，雜質(zhì)峰對待測峰產(chǎn)生嚴重干擾。供試品溶液2除雜不完全，雜質(zhì)峰仍有干擾。供試品溶液3由于加入水解除雜步驟，甜菜堿無出峰，槲皮素、酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯出峰良好，無干擾，酸棗仁皂苷B出峰與雜質(zhì)峰部分重疊，達不到分離。調(diào)整梯度系統(tǒng)，增加30％A流動相的沖洗時間。結(jié)果如上：甜菜堿無出峰，槲皮素、酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯出峰良好，無干擾，酸棗仁皂苷B出峰與雜質(zhì)峰部分重疊，達不到分離。綜上所述，安神寶顆粒多成分檢測方法確定為：一、色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗：色譜柱：AgilentZorboxSBC184.6mm×150mm，5μ柱溫：柱溫35℃檢測：蒸發(fā)光散射檢測器進樣量：10μ流動相梯度洗脫表：流動相：A為甲醇，B為0.5％冰醋酸時間流動相A％流動相B％0-52-1098-905-15109015-3010-3090-7030-40307040-5530-4570-5555-65455565-809010二、對照品溶液的制備：分別精密稱取酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素對照品適量，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備液；分別精密量取上述對照品儲備液1.0ml置于同一個20ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液。三、供試品溶液的制備：取本品粉末(過四號篩)約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人70％乙醇50ml，稱定重量，加熱回流6小時，放冷，再稱定重量，用70％乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25ml，置燒瓶中，濃縮至約lml，加3mol/L鹽酸溶液l0ml，水浴中加熱水解2小時，立即冷卻，移入分液漏斗中，用水10ml分次洗滌容器，并入分液漏斗中，加氯化鈉2g，用三氯甲烷強力振搖提取5次，每次15m1,合并三氯甲烷液，加無水硫酸鈉2g，攪拌，濾過，容器用少量三氯甲烷洗滌，濾過，濾液合并，70℃以下濃縮至近干，立即加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。四、測定法：按照步驟(1)所述色譜條件測定，即得。圖4附圖說明圖1：預(yù)實驗一液相色譜圖圖2：預(yù)實驗二液相色譜圖圖3：預(yù)實驗三液相色譜圖圖4：確定實驗條件液相色譜圖具體實施方式下面列舉實施例進一步詳細說明本發(fā)明，該實施例僅用于說明本發(fā)明而對本發(fā)明沒有限制。實施例1：安神寶顆粒中所含的酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素三種化合物的高效液相色譜含量測定。一、色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗：色譜柱：AgilentZorboxSBC184.6mm×150mm，5μ柱溫：柱溫35℃檢測：蒸發(fā)光散射檢測器進樣量：10μ流動相梯度洗脫表：流動相：A為甲醇，B為0.5％冰醋酸時間流動相A％流動相B％0-52-1098-905-15109015-3010-3090-7030-40307040-5530-4570-5555-65455565-809010二、對照品溶液的制備：分別精密稱取酸棗仁皂苷A、東莨菪內(nèi)酯、槲皮素對照品適量，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備液；分別精密量取上述對照品儲備液1.0ml置于同一個20ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液。三、供試品溶液的制備：取本品粉末(過四號篩)約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人70％乙醇50ml，稱定重量，加熱回流6小時，放冷，再稱定重量，用70％乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25ml，置燒瓶中，濃縮至約lml，加3mol/L鹽酸溶液l0ml，水浴中加熱水解2小時，立即冷卻，移入分液漏斗中，用水10ml分次洗滌容器，并入分液漏斗中，加氯化鈉2g，用三氯甲烷強力振搖提取5次，每次15m1,合并三氯甲烷液，加無水硫酸鈉2g，攪拌，濾過，容器用少量三氯甲烷洗滌，濾過，濾液合并，70℃以下濃縮至近干，立即加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。四、測定法：按照步驟(1)所述色譜條件測定，即得。當前第1頁1 2 3