本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其涉及到一種避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法。

背景技術：

蛋白質(zhì)磷酸化修飾是調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的重要途徑，目前關于蛋白質(zhì)磷酸化水平的方法主要集中在測定整體磷酸化水平。磷酸化修飾可能發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸上，其中絲氨酸的磷酸化修飾是數(shù)量最多的，對于肌原纖維蛋白磷酸化的生化變化進行研究，以及基于肌原纖維蛋白磷酸化對動物肌肉生理生化的研究是科學研究中必不可少的。雖然現(xiàn)有技術中也有針對某種氨基酸的特異性抗體，但是肌原纖維蛋白種類繁多，各類之間含量差異巨大，雖然質(zhì)譜可以檢測到多種蛋白的磷酸化水平及磷酸化位點，但是單次檢測樣品少，價格高，數(shù)據(jù)分析復雜，目前還沒有針對某種肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的免疫印跡檢測方法。因此，一種可多蛋白識別、檢測快速、價格低的測定肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的方法是亟需的。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法，按不同肌原纖維蛋白含量、分子量、信號響應值將不同肌原纖維蛋白區(qū)分開進行免疫印跡。

本發(fā)明再有一個目的是提供一種避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法，避免各種肌原纖維蛋白之間絲氨酸磷酸化信號互相干擾，通過利用免疫印跡實現(xiàn)了對不同肌原纖維蛋白磷酸化水平的測定，解決了現(xiàn)有方法中不能準確檢測某一種肌原纖維蛋白、操作繁瑣、費用昂貴的問題。

本發(fā)明提供一種避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法，包括以下步驟：

將肌原纖維蛋白樣品的蛋白濃度調(diào)至2μg/μl；

將蛋白marker及肌原纖維蛋白樣品分別上樣至不同電泳泳道，電泳電壓采用恒壓200v，待肌原纖維蛋白樣品溴酚藍標記跑至距離膠底物0.5mm停止電泳；

通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測肌原纖維蛋白樣品中絲氨酸磷酸化水平。

優(yōu)選的是，所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，蛋白marker與肌原纖維蛋白兩條泳道之間留一條空白泳道。

優(yōu)選的是，所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，

對于分子量大于等于100kda的目標蛋白，所選分離膠濃度為7.5％；

對于分子量高于40kda且小于100kda的目標蛋白，所選分離膠濃度為10％；

對于分子量小于等于40kda的目標蛋白，所選分離膠濃度為12％；

優(yōu)選的是，所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，

蛋白marker上樣量為2μl；

對于肌原纖維蛋白中含量較高的肌球蛋白重鏈、肌動蛋白上樣量為2.5μg，對于其他肌原纖維蛋白上樣量為10μg。

優(yōu)選的是，所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測所述肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平過程中，與所述肌原纖維蛋白反應的第一抗體采用絲氨酸磷酸化單克隆抗體，所述第一抗體的濃度為60-80μg/ml。

優(yōu)選的是，所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測所述肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平過程中，與所述第一抗體結(jié)合的第二抗體采用羊抗鼠igg，所述第二抗體的濃度為0.05-0.2μg/ml。

優(yōu)選的是，所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，在通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測所述磷酸化的肌原纖維蛋白樣品的絲氨酸磷酸化水平過程中，

對于分子量大于等于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，4.5min；

對于分子量高于40kda且小于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，3.5min；

對于分子量小于等于40kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，2.5min。

優(yōu)選的是，所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，在通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測所述磷酸化的肌原纖維蛋白樣品的絲氨酸磷酸化水平過程中，與所述第一抗體混合之前，沿蛋白marker用鉛筆水平劃線并延伸至蛋白marker與肌原纖維蛋白間空余的條帶，并將該條帶垂直剪開，將剩余肌原纖維蛋白部分與所述第一抗體混合孵育。

優(yōu)選的是，所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，在通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測所述磷酸化的肌原纖維蛋白樣品的絲氨酸磷酸化水平過程中，

若檢測目標非肌球蛋白重鏈、肌動蛋白，在與第一抗體混合之前，沿蛋白marker水平剪去膜中分子量大于220kda條帶、40-45kda條帶部分，將剩余部分切角標記，與第一抗體混合；

若檢測目標為肌球蛋白重鏈與肌動蛋白，與第一抗體混合之前，沿蛋白marker水平剪去膜中分子量180kda條帶以下部分、及34-55kda條帶部分，將剩余部分切角標記。

優(yōu)選的是，所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法，其特征在于，所述肌原纖維蛋白樣品取自羊。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

本發(fā)明提供的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法，通過蛋白質(zhì)免疫印跡技術同樣可以在宰后肌肉中檢測出不同肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平，所需的肌肉樣品量少，操作過程較為簡單，重復性好，檢測所得條帶清晰，實驗價格低，是一種高效測定宰后肌肉中肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的方法。利用該方法可對羊骨骼肌中絲氨酸磷酸化肌原纖維蛋白的生化變化進行研究分析，也可延伸至其他動物肌肉生理生化的研究。

本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提供的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法的實施例1中不同濃度凝膠經(jīng)過不同時間轉(zhuǎn)膜后肌球蛋白成像圖；

圖2為本發(fā)明提供的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法的實施例1中不同濃度凝膠經(jīng)過不同時間轉(zhuǎn)膜后肌間線蛋白成像圖；

圖3為本發(fā)明提供的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法的實施例1中不同濃度凝膠經(jīng)過不同時間轉(zhuǎn)膜后肌動蛋白成像圖；

圖4為本發(fā)明提供的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法的實施例1中不同濃度凝膠經(jīng)過不同時間轉(zhuǎn)膜后肌鈣蛋白t成像圖；

圖5為本發(fā)明提供的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法的實施例2中蛋白marker對曝光信號干擾圖；

圖6為本發(fā)明提供的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法的實施例4中肌球蛋白重鏈絲氨酸磷酸化曝光成像圖；

圖7為本發(fā)明提供的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法的實施例4中肌動蛋白絲氨酸磷酸化曝光成像圖；

圖8為本發(fā)明提供的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法的實施例5中肌原纖維蛋白(肌球蛋白重鏈及肌動蛋白除外)絲氨酸磷酸化曝光成像圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。

應當理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術語并不配出一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。

本發(fā)明提供一種避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法，包括以下步驟：

將肌原纖維蛋白樣品的蛋白濃度調(diào)至2μg/μl；

將蛋白marker及肌原纖維蛋白樣品分別上樣至不同電泳泳道，電泳電壓采用恒壓200v，待肌原纖維蛋白樣品溴酚藍標記跑至距離膠底物0.5mm停止電泳；

通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測肌原纖維蛋白樣品中絲氨酸磷酸化水平。

所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，蛋白marker與肌原纖維蛋白兩條泳道之間留一條空白泳道。

所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，

對于分子量大于等于100kda的目標蛋白，所選分離膠濃度為7.5％；

對于分子量高于40kda且小于100kda的目標蛋白，所選分離膠濃度為10％；

對于分子量小于等于40kda的目標蛋白，所選分離膠濃度為12％；

所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，蛋白marker上樣量為2μl；

對于肌原纖維蛋白中含量較高的肌球蛋白重鏈、肌動蛋白上樣量為2.5μg，對于其他肌原纖維蛋白上樣量為10μg。

所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測所述肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平過程中，與所述肌原纖維蛋白反應的第一抗體采用絲氨酸磷酸化單克隆抗體，所述第一抗體的濃度為60-80μg/ml，或70μg/ml。

所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測所述肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平過程中，與所述第一抗體結(jié)合的第二抗體采用羊抗鼠igg，所述第二抗體的濃度為0.05-0.2μg/ml。

所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，在通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測所述磷酸化的肌原纖維蛋白樣品的絲氨酸磷酸化水平過程中，

對于分子量大于等于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，4.5min；

對于分子量高于40kda且小于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，3.5min；

對于分子量小于等于40kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，2.5min。

所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，在通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測所述磷酸化的肌原纖維蛋白樣品的絲氨酸磷酸化水平過程中，與所述第一抗體混合之前，沿蛋白marker用鉛筆水平劃線并延伸至蛋白marker與肌原纖維蛋白間空余的條帶，并將該條帶垂直剪開，將剩余肌原纖維蛋白部分與所述第一抗體混合孵育。

所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，在通過蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測所述磷酸化的肌原纖維蛋白樣品的絲氨酸磷酸化水平過程中，

若檢測目標非肌球蛋白重鏈、肌動蛋白，在與第一抗體混合之前，沿蛋白marker水平剪去膜中分子量大于220kda條帶、40-45kda條帶部分，將剩余部分切角標記，與第一抗體混合；

若檢測目標為肌球蛋白重鏈與肌動蛋白，與第一抗體混合之前，沿蛋白marker水平剪去膜中分子量180kda條帶以下部分、及34-55kda條帶部分，將剩余部分切角標記。

所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法中，所述的避免信號干擾的肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化水平的測定方法，其特征在于，所述肌原纖維蛋白樣品取自羊。

本發(fā)明中用到的試劑和試劑盒：

2×還原性上樣緩沖液：10％sds4ml，甘油2ml，0.5mtris-hclph6.82ml，1mdtt2.0ml，溴酚藍0.01g：

7.5％、10％、12％的分離膠及4％的濃縮膠：bio-rad#1610181，#1610183，#1610185；

tbs緩沖液：tris1.211g，nacl8.76g，1mol/l的hcl調(diào)ph至7.5；

封閉液中包含：tbs50ml/l，tween2025μl/l，bsa1.5g/l：

tbst1：每500mltbs加0.5mltween20；

tbst2：tris3.0275g，nacl4.38g，tween200.5ml，hcl調(diào)ph至7.5，定容至500ml；

蛋白質(zhì)標準品：thermo#26616；

ecl顯色法中使用的試劑盒為：bio-rad#1705061；

bca法測定提取樣品的蛋白濃度使用的試劑盒為thermo#23225；

下述實施例均采用bio-rad單向電泳系統(tǒng)、bio-rad半干法轉(zhuǎn)膜儀及bio-rad凝膠成像系統(tǒng)。

實施例1

a)取部分-80℃保存的羊背最長肌肌原纖維蛋白樣品，bca法測定蛋白濃度；

b)sds-page電泳：采用7.5％、10％、12％的分離膠和4％的濃縮膠，凝膠的每孔均加入10μg或2μg蛋白樣品，蛋白marker上樣量為2μl，對于肌原纖維蛋白中含量較高的肌球蛋白重鏈、肌動蛋白上樣量為2.5μg，對于其他肌原纖維蛋白上樣量為10μg；對于分子量大于等于100kda的目標蛋白，采用7.5％的分離膠，對于分子量高于40kda且小于100kda的目標蛋白，采用10％的分離膠，對于分子量小于等于40kda的目標蛋白，采用12％的分離膠；電泳電壓采用恒壓200v，待樣品溴酚藍標記跑至距離膠底物0.5mm停止電泳；

c)蛋白質(zhì)免疫印跡(ib)：電泳結(jié)束后卸下膠板，將凝膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡；pvdf膜用純甲醇活化15s，與準備好的轉(zhuǎn)膜專用濾紙一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡；以半干法轉(zhuǎn)膜技術，使得凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至pvdf膜上；對于分子量大于等于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，4.5min，對于分子量高于40kda且小于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，3.5min，對于分子量小于等于40kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，2.5min；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用tbs緩沖液洗滌pvdf膜三次，每次3min；

將pvdf膜放入裁剪好的雜交袋中，加入5ml封閉液，室溫下在搖床上震蕩封閉2h；

第一抗體簡稱一抗，一抗孵育：在5ml封閉液中加入sigma公司的磷酸化絲氨酸單克隆抗體(貨號：p3430)，濃度為70μg/ml；更換雜交袋，將pvdf膜與配制好的一抗溶液4℃過夜孵育；

第二抗體簡稱二抗，二抗孵育：用tbst1緩沖液洗滌pvdf膜三次，每次20min；在5ml封閉液中加入sigma公司的anti-mouseigg(貨號為a9044)，濃度為0.1μg/ml，作為二抗溶液與pvdf膜室溫震蕩孵育2h；

用tbst2緩沖液洗滌pvdf膜三次，每次10min，之后利用bio-rid公司的ecl(貨號為)顯色。

實施例2

a)取部分-80℃保存的羊背最長肌肌原纖維蛋白樣品，bca法測定蛋白濃度；

b)sds-page電泳：采用7.5％、10％、12％的分離膠和4％的濃縮膠，凝膠的每孔均加入10μg或2μg蛋白樣品，蛋白marker上樣量為2μl，對于肌原纖維蛋白中含量較高的肌球蛋白重鏈、肌動蛋白上樣量為2.5μg，對于其他肌原纖維蛋白上樣量為10μg；對于分子量大于等于100kda的目標蛋白，采用7.5％的分離膠，對于分子量高于40kda且小于100kda的目標蛋白，采用10％的分離膠，對于分子量小于等于40kda的目標蛋白，采用12％的分離膠；電泳電壓采用恒壓200v，待樣品溴酚藍標記跑至距離膠底物0.5mm停止電泳；

c)蛋白質(zhì)免疫印跡(ib)：電泳結(jié)束后卸下膠板，將凝膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡；pvdf膜用純甲醇活化15s，與準備好的轉(zhuǎn)膜專用濾紙一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡；以半干法轉(zhuǎn)膜技術，使得凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至pvdf膜上；對于分子量大于等于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，4.5min，對于分子量高于40kda且小于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，3.5min，對于分子量小于等于40kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，2.5min；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用tbs緩沖液洗滌pvdf膜三次，每次3min；

將pvdf膜放入裁剪好的雜交袋中，加入5ml封閉液，室溫下在搖床上震蕩封閉2h；

將蛋白marker從pvdf膜剪下；

第一抗體簡稱一抗，一抗孵育：在5ml封閉液中加入sigma公司的磷酸化絲氨酸單克隆抗體(貨號：p3430)，濃度為70μg/ml；更換雜交袋，將剪掉蛋白marker的pvdf膜與配制好的一抗溶液4℃過夜孵育；

第二抗體簡稱二抗，二抗孵育：用tbst1緩沖液洗滌pvdf膜三次，每次20min；在5ml封閉液中加入sigma公司的anti-mouseigg(貨號為a9044)，濃度為0.1μg/ml，作為二抗溶液與pvdf膜室溫震蕩孵育2h；

用tbst2緩沖液洗滌pvdf膜三次，每次10min，之后利用bio-rid公司的ecl(貨號為)顯色。

實施例3

a)取部分-80℃保存的羊背最長肌肌原纖維蛋白樣品，bca法測定蛋白濃度；

b)sds-page電泳：采用7.5％、10％、12％的分離膠和4％的濃縮膠，凝膠的每孔均加入10μg或2μg蛋白樣品，蛋白marker上樣量為2μl，對于肌原纖維蛋白中含量較高的肌球蛋白重鏈、肌動蛋白上樣量為2.5μg，對于其他肌原纖維蛋白上樣量為10μg；對于分子量大于等于100kda的目標蛋白，采用7.5％的分離膠，對于分子量高于40kda且小于100kda的目標蛋白，采用10％的分離膠，對于分子量小于等于40kda的目標蛋白，采用12％的分離膠；蛋白marker和樣品之間隔一空白泳道不上樣，電泳電壓采用恒壓200v，待樣品溴酚藍標記跑至距離膠底物0.5mm停止電泳；

c)蛋白質(zhì)免疫印跡(ib)：電泳結(jié)束后卸下膠板，將凝膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡；pvdf膜用純甲醇活化15s，與準備好的轉(zhuǎn)膜專用濾紙一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡；以半干法轉(zhuǎn)膜技術，使得凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至pvdf膜上；對于分子量大于等于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，4.5min，對于分子量高于40kda且小于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，3.5min，對于分子量小于等于40kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，2.5min；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用tbs緩沖液洗滌pvdf膜三次，每次3min；

將pvdf膜放入裁剪好的雜交袋中，加入5ml封閉液，室溫下在搖床上震蕩封閉2h；

沿蛋白marker水平用鉛筆劃線，延伸至蛋白marker與肌原纖維蛋白間空余的條帶，將蛋白marker從pvdf膜沿蛋白marker與樣品之間的空白條帶中間剪下；

第一抗體簡稱一抗，一抗孵育：在5ml封閉液中加入sigma公司的磷酸化絲氨酸單克隆抗體(貨號：p3430)，濃度為70μg/ml；更換雜交袋，將剪掉蛋白marker的pvdf膜與配制好的一抗溶液4℃過夜孵育；

第二抗體簡稱二抗，二抗孵育：用tbst1緩沖液洗滌pvdf膜三次，每次20min；在5ml封閉液中加入sigma公司的anti-mouseigg(貨號為a9044)，濃度為0.1μg/ml，作為二抗溶液與pvdf膜室溫震蕩孵育2h；

用tbst2緩沖液洗滌pvdf膜三次，每次10min，之后利用bio-rid公司的ecl(貨號為)顯色。

實施例4

a)取部分-80℃保存的羊背最長肌肌原纖維蛋白樣品，bca法測定蛋白濃度；

b)sds-page電泳：采用7.5％、10％、12％的分離膠和4％的濃縮膠，凝膠的每孔均加入10μg或2μg蛋白樣品，蛋白marker上樣量為2μl，對于肌原纖維蛋白中含量較高的肌球蛋白重鏈、肌動蛋白上樣量為2.5μg，對于其他肌原纖維蛋白上樣量為10μg；對于分子量大于等于100kda的目標蛋白，采用7.5％的分離膠，對于分子量高于40kda且小于100kda的目標蛋白，采用10％的分離膠，對于分子量小于等于40kda的目標蛋白，采用12％的分離膠；蛋白marker和樣品之間隔一空白泳道不上樣，電泳電壓采用恒壓200v，待樣品溴酚藍標記跑至距離膠底物0.5mm停止電泳；

c)蛋白質(zhì)免疫印跡(ib)：電泳結(jié)束后卸下膠板，將凝膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡；pvdf膜用純甲醇活化15s，與準備好的轉(zhuǎn)膜專用濾紙一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡；以半干法轉(zhuǎn)膜技術，使得凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至pvdf膜上；對于分子量大于等于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，4.5min，對于分子量高于40kda且小于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，3.5min，對于分子量小于等于40kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，2.5min；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用tbs緩沖液洗滌pvdf膜三次，每次3min；

將pvdf膜放入裁剪好的雜交袋中，加入5ml封閉液，室溫下在搖床上震蕩封閉2h；

沿蛋白marker水平用鉛筆劃線，延伸至蛋白marker與肌原纖維蛋白間空余的條帶，將蛋白marker從pvdf膜沿蛋白marker與樣品之間的空白條帶中間剪下；

若檢測目標為肌動球蛋白、肌動蛋白，在與第一抗體混合之前，沿蛋白marker水平剪去膜中分子量180kda條帶以下部分、及34-55kda條帶部分，將剩余部分切角標記；

第一抗體簡稱一抗，一抗孵育：在5ml封閉液中加入sigma公司的磷酸化絲氨酸單克隆抗體(貨號：p3430)，濃度為70μg/ml；更換雜交袋，將剪掉蛋白marker的pvdf膜與配制好的一抗溶液4℃過夜孵育；

第二抗體簡稱二抗，二抗孵育：用tbst1緩沖液洗滌pvdf膜三次，每次20min；在5ml封閉液中加入sigma公司的anti-mouseigg(貨號為a9044)，濃度為0.1μg/ml，作為二抗溶液與pvdf膜室溫震蕩孵育2h；

用tbst2緩沖液洗滌pvdf膜三次，每次10min，之后利用bio-rid公司的ecl(貨號為)顯色。

實施例5

a)取部分-80℃保存的羊背最長肌肌原纖維蛋白樣品，bca法測定蛋白濃度；

b)sds-page電泳：采用7.5％、10％、12％的分離膠和4％的濃縮膠，凝膠的每孔均加入10μg或2μg蛋白樣品，蛋白marker上樣量為2μl，對于肌原纖維蛋白中含量較高的肌球蛋白重鏈、肌動蛋白上樣量為2.5μg，對于其他肌原纖維蛋白上樣量為10μg；對于分子量大于等于100kda的目標蛋白，采用7.5％的分離膠，對于分子量高于40kda且小于100kda的目標蛋白，采用10％的分離膠，對于分子量小于等于40kda的目標蛋白，采用12％的分離膠；蛋白marker和樣品之間隔一空白泳道不上樣，電泳電壓采用恒壓200v，待樣品溴酚藍標記跑至距離膠底物0.5mm停止電泳；

c)蛋白質(zhì)免疫印跡(ib)：電泳結(jié)束后卸下膠板，將凝膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡；pvdf膜用純甲醇活化15s，與準備好的轉(zhuǎn)膜專用濾紙一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡；以半干法轉(zhuǎn)膜技術，使得凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至pvdf膜上；對于分子量大于等于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，4.5min，對于分子量高于40kda且小于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，3.5min，對于分子量小于等于40kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，2.5min；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用tbs緩沖液洗滌pvdf膜三次，每次3min；

將pvdf膜放入裁剪好的雜交袋中，加入5ml封閉液，室溫下在搖床上震蕩封閉2h；

沿蛋白marker水平用鉛筆劃線，延伸至蛋白marker與肌原纖維蛋白間空余的條帶，將蛋白marker從pvdf膜沿蛋白marker與樣品之間的空白條帶中間剪下；

若檢測目標非肌動球蛋白、肌動蛋白，在與第一抗體混合之前，沿蛋白marker水平剪去膜中分子量大于220kda條帶、40-45kda條帶部分，將剩余部分切角標記；

第一抗體簡稱一抗，一抗孵育：在5ml封閉液中加入sigma公司的磷酸化絲氨酸單克隆抗體(貨號：p3430)，濃度為70μg/ml；更換雜交袋，將剪掉蛋白marker的pvdf膜與配制好的一抗溶液4℃過夜孵育；

第二抗體簡稱二抗，二抗孵育：用tbst1緩沖液洗滌pvdf膜三次，每次20min；在5ml封閉液中加入sigma公司的anti-mouseigg(貨號為a9044)，濃度為0.1μg/ml，作為二抗溶液與pvdf膜室溫震蕩孵育2h；

用tbst2緩沖液洗滌pvdf膜三次，每次10min，之后利用bio-rid公司的ecl(貨號為)顯色。

如圖1、圖2、圖3和圖4所示，分別采用7.5％、10％、12％的分離膠進行凝膠電泳，目標為肌球蛋白及肌動蛋白，上樣量為2.5μg，目標為其他蛋白，上樣量為10μg，對于分子量大于等于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，4.5min，對于分子量高于40kda且小于100kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，3.5min，對于分子量小于等于40kda的目標蛋白，轉(zhuǎn)膜條件為半干法轉(zhuǎn)膜，3ma，2.5min。肌球蛋白重鏈分子量約為220kda，肌間線蛋白分子量約為55kda，肌動蛋白分子量約為43kda，肌鈣蛋白t分子量約為37kda。采用上述條件，以對應的抗體檢測肌球蛋白重鏈、肌間線蛋白、肌動蛋白、肌鈣蛋白t，所檢測到的條帶清晰，且轉(zhuǎn)膜后pvdf膜上無目標蛋白殘留。

圖5是實施例2所得的結(jié)果，如圖5所示，采用自動曝光，只能觀察到清晰的蛋白marker的條帶，說明marker也存在絲氨酸磷酸化現(xiàn)象，過度曝光后，能觀察到肌原纖維蛋白中一些蛋白的絲氨酸磷酸化修飾現(xiàn)象，但蛋白marker對相鄰泳道產(chǎn)生較強的信號干擾，剪掉marker后進行過度曝光，肌原纖維蛋白中一些蛋白的絲氨酸磷酸化信號更強，但是與marker相鄰的泳道仍然存在信號干擾現(xiàn)象。

圖6和圖7是實施例4所得的結(jié)果，同時采用了實施例3的方法，如圖3所示，肌球蛋白重鏈及肌動蛋白是肌原纖維蛋白中含量最高的兩種蛋白，將兩個蛋白所在分子量范圍的部分在一抗孵育前從pvdf膜上剪下，可以得到清晰的絲氨酸磷酸化條帶，且將蛋白marker與樣品隔一個泳道上樣，成功排除了marker的信號干擾。

圖8是實施例5所得的結(jié)果，同時采用了實施例3的方法，如圖8所示，將肌球蛋白重鏈及肌動蛋白從pvdf膜上剪掉后，可以成功避免這兩種蛋白對含量相對較低的其他蛋白的信號干擾，能檢測到多條絲氨酸磷酸化條帶；且將蛋白marker與樣品隔一個泳道上樣，成功排除了marker的信號干擾；同時在剪蛋白marker之前，沿蛋白marker水平用鉛筆劃線，延伸至蛋白marker與肌原纖維蛋白間空余的條帶，可以標記蛋白分子量，在排除蛋白marker干擾的同時也發(fā)揮了蛋白marker的作用。

這里說明的處理規(guī)模是用來簡化本發(fā)明的說明的。對本發(fā)明的磷酸化方法和蛋白質(zhì)免疫沉淀及免疫印跡等方法的應用、修改和變化對本領域的技術人員來說是顯而易見的。

如上所述，根據(jù)本發(fā)明，檢測羊背最長肌中肌原纖維蛋白絲氨酸取得了成功，且，經(jīng)反復實驗，本發(fā)明方法實驗重復性好，結(jié)果可靠，可為羊等動物骨骼肌中肌原纖維蛋白絲氨酸磷酸化檢測研究提供技術范例。

盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。