本發(fā)明屬于分析化學(xué)，具體涉及一種基于hplc法分離測(cè)定卡泊三醇及其雜質(zhì)j的方法。

背景技術(shù)：

1、卡泊三醇主要用于尋常型銀屑病的局部治療?？ú慈即嬖跓o水物和一水合物兩種形式，無水物化學(xué)名稱為(5z,7e,22e,24s)-24-環(huán)丙基-9,10-開環(huán)膽甾-5,7,10(19),22-四烯-1α,3β,24-三醇，其分子式為c27h40o3，分子量為412.60。一水合物化學(xué)名稱為(5z,7e,22e,24s)-24-環(huán)丙基-9,10-開環(huán)膽甾-5,7,10(19),22-四烯-1α,3β,24-三醇一水合物，其分子式為c27h40o3·h2o，分子量為430.63?？ú慈嫉臒o水物和一水合物的結(jié)構(gòu)式分別如式ⅰ和式ⅱ所示。

2、卡泊三醇在合成過程中會(huì)產(chǎn)生特有的工藝雜質(zhì)，雜質(zhì)j，工藝清除率不佳。在ep/usp/bp有關(guān)物質(zhì)分析方法中，雜質(zhì)j與卡泊三醇重合，ep/usp/bp藥典方法無法檢測(cè)該雜質(zhì)。雜質(zhì)j的結(jié)構(gòu)式如式ⅲ所示。

3、

4、因此，為了避免雜質(zhì)j對(duì)產(chǎn)品純度和質(zhì)量產(chǎn)生影響，需建立新方法將卡泊三醇與雜質(zhì)j進(jìn)行分離和測(cè)定，以控制卡泊三醇的質(zhì)量。

5、現(xiàn)有技術(shù)中，公開號(hào)為cn106908559b的發(fā)明專利公開了一種卡泊三醇中間體l及相關(guān)雜質(zhì)的分離與測(cè)定方法，該專利采用硅膠為固定相，以乙酸乙酯-正己烷為流動(dòng)相進(jìn)行分離測(cè)定。公開號(hào)為cn113533568b的發(fā)明專利公開了一種基于hplc法檢測(cè)卡泊三醇軟膏中前卡泊三醇、雜質(zhì)c和雜質(zhì)d的方法，該專利采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱的填充劑，以水和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行檢測(cè)。然而上述發(fā)明專利均無法實(shí)現(xiàn)卡泊三醇中雜質(zhì)j的定性和定量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于高效液相色譜法同時(shí)分離卡泊三醇和雜質(zhì)j的方法，該方法實(shí)現(xiàn)了卡泊三醇中雜質(zhì)j的有效分離，為后期卡泊三醇中雜質(zhì)j的定性和定量提供了技術(shù)支持。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、基于高效液相色譜法同時(shí)分離卡泊三醇和雜質(zhì)j的方法，被分離的組分為卡泊三醇和雜質(zhì)j；所述雜質(zhì)j的結(jié)構(gòu)式如式ⅲ所示；所述方法為：采用表面涂敷有淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)的硅膠為色譜柱固定相，流動(dòng)相為無水乙醇和正己烷的混合溶液；所述流動(dòng)相中無水乙醇和正己烷的體積比為15-25：85-75；通過等度洗脫依次將雜質(zhì)j和卡泊三醇進(jìn)行分離；

4、

5、進(jìn)一步，所述卡泊三醇為卡泊三醇無水物和/或卡泊三醇一水合物；所述卡泊三醇無水物的結(jié)構(gòu)式如式ⅰ所示，所述卡泊三醇一水合物如式ⅱ所示；

6、

7、進(jìn)一步，所述流動(dòng)相中無水乙醇和正己烷的體積比為18-22：82-78。

8、作為更優(yōu)選，所述流動(dòng)相中無水乙醇和正己烷的體積比為20：80。

9、作為優(yōu)選，色譜柱為chiralpak?ad-h，其規(guī)格為250mm×4.6mm，5μm。

10、作為優(yōu)選，柱溫為20℃-30℃，優(yōu)選為25℃。

11、作為優(yōu)選，進(jìn)樣體積為20μl。

12、進(jìn)一步，分離前，采用稀釋劑配制供試品溶液和對(duì)照溶液。

13、作為優(yōu)選，所述供試品溶液的濃度為0.4mg/ml，所述對(duì)照溶液的濃度為0.6μg/ml。

14、作為優(yōu)選，所述稀釋劑為流動(dòng)相、無水乙醇或甲醇。

15、作為更優(yōu)選，所述稀釋劑為無水乙醇和正己烷的混合溶液，其中，無水乙醇和正己烷的體積比為20：80。

16、進(jìn)一步，所述流動(dòng)相的流速為0.5ml/min-1.5ml/min，優(yōu)選為0.6ml/min-1.0ml/min，更優(yōu)選為0.8ml/min。

17、本發(fā)明的目的之二在于提供一種定性鑒別卡泊三醇和雜質(zhì)j的方法。

18、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

19、定性鑒別卡泊三醇和雜質(zhì)j的方法，采用目的一所述的方法分離卡泊三醇和雜質(zhì)j，分離后采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)波長(zhǎng)為264±2nm。

20、作為優(yōu)選，檢測(cè)波長(zhǎng)為264nm。

21、進(jìn)一步，保留時(shí)間由短到長(zhǎng)依次為雜質(zhì)j和卡泊三醇。

22、可根據(jù)保留時(shí)間長(zhǎng)短進(jìn)行定性。

23、進(jìn)一步，所述流動(dòng)相中無水乙醇和正己烷的體積比為20：80，所述流動(dòng)相的流速為0.8ml/min，色譜柱為chiralpak?ad-h，其規(guī)格為250mm×4.6mm，5μm，柱溫為25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為264nm；按照上述條件進(jìn)行等度洗脫并得到色譜圖。

24、當(dāng)保留時(shí)間為6.8±0.5min時(shí)，判定為所述雜質(zhì)j；當(dāng)保留時(shí)間為11.0±0.5min時(shí)，判定為所述卡泊三醇。

25、本發(fā)明的目的之三在于提供一種定量檢測(cè)卡泊三醇和雜質(zhì)j的方法。

26、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

27、定量檢測(cè)卡泊三醇和雜質(zhì)j的方法，包括以下步驟：

28、(1)分離：采用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法分離卡泊三醇和雜質(zhì)j；

29、(2)檢測(cè)：采用權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述的方法對(duì)卡泊三醇和雜質(zhì)j進(jìn)行檢測(cè)；

30、(3)含量測(cè)定：根據(jù)步驟(2)測(cè)得的色譜圖，按主成分自身對(duì)照法計(jì)算卡泊三醇和雜質(zhì)j的含量。

31、進(jìn)一步，所述雜質(zhì)j在濃度0.1893μg/ml～3.7860μg/ml范圍內(nèi)，y＝1.1231x-0.0526，r＝0.9996；和/或所述卡泊三醇在濃度0.2003μg/ml～4.0055μg/ml范圍內(nèi)，y＝1.1681x-0.0729，r＝0.9997；其中，y為y軸，表示峰面積；x為x軸，表示濃度，r表示相關(guān)系數(shù)。根據(jù)線性斜率，計(jì)算所得雜質(zhì)j的校正因子在0.9～1.1范圍內(nèi)，雜質(zhì)定量計(jì)算時(shí)可按1.0計(jì)。

32、進(jìn)一步，根據(jù)所述檢測(cè)器檢測(cè)出的峰面積使用主成分自身對(duì)照法計(jì)算卡泊三醇中雜質(zhì)j的含量，具體包括以下步驟：

33、1.配制供試品溶液：精密量取供試品加稀釋劑溶解，制得濃度為0.4mg/ml的供試品溶液；

34、2.配制對(duì)照溶液：精密量取供試品溶液適量，用稀釋劑稀釋制成濃度為0.6μg/ml的對(duì)照溶液；

35、3.取步驟1制得供試品溶液和步驟2制得的對(duì)照溶液進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，按主成分自身對(duì)照法計(jì)算卡泊三醇中雜質(zhì)j的含量。

36、進(jìn)一步，配制標(biāo)準(zhǔn)品，得標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖；測(cè)試樣品所得色譜圖，按主成分自身對(duì)照法對(duì)峰面積進(jìn)行計(jì)算。

37、所述標(biāo)準(zhǔn)品為已知組份含量，所述測(cè)試樣品組份含量為未知。

38、所得的標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖可以儲(chǔ)存于數(shù)據(jù)庫中，作為智慧藥廠中質(zhì)量控制的圖譜素材，用于幫助機(jī)器人判定其生產(chǎn)的產(chǎn)品是否合格，對(duì)不合格的產(chǎn)品給出可定量的改進(jìn)分析建議。

39、本發(fā)明的有益效果在于：

40、1.本發(fā)明利用高效液相色譜法分離測(cè)定卡泊三醇及其雜質(zhì)j，實(shí)現(xiàn)了雜質(zhì)有效控制，從根本上確定了產(chǎn)品質(zhì)量，具有專屬、靈敏、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明為卡泊三醇的質(zhì)量控制和制劑產(chǎn)品的質(zhì)量提升提供了技術(shù)支持。

41、2.本發(fā)明的檢測(cè)方法可在30分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)卡泊三醇及其雜質(zhì)j的測(cè)定，卡泊三醇的定量限濃度為0.1905μg/ml，雜質(zhì)j的定量限濃度為0.1913μg/ml，卡泊三醇的檢測(cè)限濃度為0.07620μg/ml，雜質(zhì)j的檢測(cè)限濃度為0.07650μg/ml。該檢測(cè)方法靈敏度高，實(shí)用性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，對(duì)于實(shí)現(xiàn)卡泊三醇的質(zhì)量控制具有重要的意義。