本發(fā)明涉及生物傳感器，尤其涉及一種檢測(cè)鮮味肽與鮮味受體相互作用的生物傳感器及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、鮮味是由鮮味物質(zhì)和鮮味受體之間的相互作用引起的，并通過受體細(xì)胞觸發(fā)的級(jí)聯(lián)信號(hào)被大腦感知。越來越多的新型鮮味肽被發(fā)現(xiàn)，并在食品工業(yè)中發(fā)揮著重要的作用，例如醬油和蠔油的鮮味特性就是鮮味肽體現(xiàn)的。與傳統(tǒng)的增味劑如味精相比，鮮味肽不僅具有更理想的風(fēng)味特征和更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)具有多種潛在的生物活性，如抗氧化、ace抑制、抗菌等。目前評(píng)價(jià)鮮味肽的方法主要依賴于人的感官評(píng)估和智能儀器分析，這些方法存在耗時(shí)費(fèi)力、人員需求量大等問題，并且測(cè)試結(jié)果容易收到環(huán)境因素的影響，不能深入研究感知系統(tǒng)中的生理信號(hào)傳導(dǎo)過程。特別值得關(guān)注的是，在微觀水平上的受體-配體結(jié)合-解離動(dòng)力學(xué)以及鮮味肽協(xié)同相互作用，這種理解的缺乏阻礙了對(duì)鮮味感知的理論研究，并阻礙了新型天然風(fēng)味增強(qiáng)劑的開發(fā)。

2、在評(píng)估分子相互作用和理解生物過程時(shí)，傳統(tǒng)方法如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)、熒光光譜法和等溫滴定量熱法(itc)已被廣泛采用，這些方法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求較為苛刻，需要熟練的操作人員，并且不能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子間相互作用的動(dòng)態(tài)過程，并且通常由于需要使用標(biāo)簽標(biāo)記分子而大大限制其實(shí)際應(yīng)用的空間。表面等離子體共振(spr)作為一種無標(biāo)記的實(shí)時(shí)分析技術(shù)，緩解了上述問題，該技術(shù)利用金屬片折射率的變化來提供關(guān)于相互作用結(jié)合動(dòng)力學(xué)的信息，已在篩選、鑒定和檢測(cè)鮮味肽領(lǐng)域得到初步應(yīng)用。然而，spr嚴(yán)重依賴蛋白質(zhì)在固相材料上的物理吸附，并伴隨著流動(dòng)相的影響，對(duì)測(cè)試結(jié)果的穩(wěn)定性帶來挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為克服現(xiàn)有檢測(cè)方法的局限性，本發(fā)明的主要目的是提供一種檢測(cè)鮮味肽與鮮味受體相互作用的生物傳感器，具有高通量和檢測(cè)快速的特性，可以對(duì)鮮味肽與受體蛋白的相互作用進(jìn)行快速評(píng)價(jià)和規(guī)律性研究。

2、本發(fā)明的另一目的是提供所述生物傳感器的制備方法，可以高通量快速檢測(cè)鮮味肽與鮮味受體的結(jié)合解離過程并計(jì)算其動(dòng)力學(xué)常數(shù)，修飾探針通過激活末端胺基后共價(jià)偶聯(lián)鮮味肽得到，不同濃度的受體蛋白以游離狀態(tài)放置于傳感托盤內(nèi)。

3、本發(fā)明的再一目的是提供所述生物傳感器的應(yīng)用，通過其高通量快速檢測(cè)鮮味肽與鮮味受體結(jié)合解離過程并計(jì)算其動(dòng)力學(xué)常數(shù)，量化鮮味肽與鮮味受體的相互作用效果，在實(shí)際樣品中評(píng)價(jià)鮮味肽與鮮味受體蛋白的相互作用信號(hào)響應(yīng)。

4、本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方法實(shí)現(xiàn)：

5、第一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)鮮味肽與鮮味受體相互作用的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

6、(1)對(duì)ar2g傳感探針進(jìn)行激活；

7、(2)將鮮味肽溶液偶聯(lián)到步驟(1)激活后的ar2g傳感探針表面，室溫孵育8～12h；

8、(3)將乙醇胺溶液浸泡到步驟(2)孵育后的ar2g傳感探針表面，封閉其非特異性結(jié)合位點(diǎn)；

9、(4)將(3)處理后的ar2g傳感探針表面，使用超純水清洗，得到修飾探針；

10、(5)將步驟(4)所得修飾探針與傳感托盤組成受體-配體體系，即得；

11、其中，所述傳感托盤內(nèi)放置有通過異源表達(dá)并復(fù)性t1r1-vft受體蛋白溶液，其中t1r1-vft表示人類鮮味受體t1r1亞單位的維納斯捕蠅器結(jié)構(gòu)域vft。

12、作為優(yōu)選，所述t1r1-vft受體蛋白的制備方法為：將含有目標(biāo)基因tas1r1-vft的質(zhì)粒pet-dest42轉(zhuǎn)染到大腸桿菌bl21中，并將預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到200ml的lb培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)，直到600nm處的吸光度達(dá)到0.6，隨后通過添加0.5mm的異丙基β-d-1-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)并在16℃下孵育8～12h，在9500rpm/min下離心15～20min收集細(xì)菌顆粒，之后在pbs緩沖液中重新懸浮細(xì)菌顆粒，使用超聲波細(xì)胞破碎器在300w功率下開/關(guān)2s對(duì)細(xì)菌顆粒進(jìn)行超聲裂解10～15min，裂解的細(xì)菌顆粒在9500rpm/min下離心20～30min，將細(xì)菌顆粒重新懸浮在50ml洗滌緩沖液中，重復(fù)上述步驟三次，將沉淀溶解在含有20mm?sds的tris-hcl緩沖液中透析8～12h，用透析膜在2l透析緩沖液中透析，溶解液離心后使用0.22μm水相膜進(jìn)行過濾，濾出液加入到平衡后的ni2+柱上，在室溫下進(jìn)行純化洗脫，在sds濃度梯度降低的溶液中重新折疊蛋白質(zhì)。

13、作為更優(yōu)選，所述t1r1-vft溶液由t1r1-vft受體蛋白溶于ph7.2、0.01m的tbs緩沖液得到。

14、作為優(yōu)選，步驟(1)中，激活ar2g傳感探針末端胺基，步驟為：將活化液注射到96微孔板中，每個(gè)孔位注射量為200～250μl，所述ar2g探針插入到微孔板中，室溫浸泡2～3h進(jìn)行活化，活化完成后使用tbs緩沖液輕輕洗去殘留在所述ar2g探針表面的活化液。

15、作為更優(yōu)選，所述活化液由0.8m的nhs和0.8m的edc按照體積比為1:1組成。

16、作為優(yōu)選，所述ar2g傳感探針與傳感托盤的相互作用經(jīng)過激活300s、封閉300s、基線60s、結(jié)合180s、解離180s五個(gè)步驟，各個(gè)步驟轉(zhuǎn)速統(tǒng)一為1000rpm?min-1，溫度設(shè)為25℃，數(shù)據(jù)采集頻率選擇2hz。

17、第二方面，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)鮮味肽與鮮味受體相互作用的生物傳感器，通過所述檢測(cè)鮮味肽與鮮味受體相互作用的生物傳感器的制備方法制得。

18、第三方面，本發(fā)明還提供所述檢測(cè)鮮味肽與鮮味受體相互作用的生物傳感器在高通量快速檢測(cè)食品中鮮味肽與鮮味受體相互作用方面的應(yīng)用。

19、作為優(yōu)選，所述食品包括蘑菇湯、醬油、河豚湯和綠茶。

20、作為優(yōu)選，使用tbs緩沖液將預(yù)處理過的實(shí)際樣品溶液偶聯(lián)到所述生物傳感器的ar2g傳感探針上，不同濃度的受體蛋白以游離狀態(tài)放置于傳感托盤內(nèi)，快速檢測(cè)實(shí)際樣品中鮮味肽與鮮味受體的結(jié)合解離過程并計(jì)算其動(dòng)力學(xué)常數(shù)。

21、本發(fā)明提出一種檢測(cè)鮮味肽與鮮味受體相互作用的生物傳感器，ar2g傳感探針基于末端胺基共價(jià)固定，經(jīng)活化后可以將鮮味肽偶聯(lián)到探針表面；傳感托盤內(nèi)放置有t1r1-vft受體蛋白溶液，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子與ar2g傳感探針的尖端接觸時(shí)，它們的結(jié)合引起生物相容性膜厚度的變化，導(dǎo)致膜兩側(cè)反射光形成的干涉圖案發(fā)生偏移，系統(tǒng)將檢測(cè)到的干擾位移轉(zhuǎn)化為響應(yīng)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)鮮味肽與鮮味受體相互作用。本發(fā)明具有快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)，并且可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，能夠滿足大批量篩選與鮮味受體蛋白具有相互作用的鮮味肽，為驗(yàn)證鮮味肽與鮮味受體蛋白的相互作用提供有效手段，并且為進(jìn)一步開發(fā)和驗(yàn)證新型小分子肽類鮮味劑及其多功能工業(yè)應(yīng)用提供理論支持和方法參考。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

22、(1)本發(fā)明的生物傳感器具有高通量與快速檢測(cè)的特點(diǎn)，最多可以同時(shí)分析96至384組鮮味肽與鮮味受體的相互作用，在1h內(nèi)完成檢測(cè)。

23、(2)本發(fā)明的生物傳感器具有良好的特異性，經(jīng)過鮮味肽修飾的ar2g傳感探針可對(duì)t1r1-vft進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別，而對(duì)bsa等其他蛋白沒有明顯的信號(hào)響應(yīng)。

24、(3)本發(fā)明的生物傳感器可用于實(shí)際樣品中鮮味肽的檢測(cè)，制備工藝簡(jiǎn)單安全，可在室溫環(huán)境檢測(cè)條件下檢測(cè)，應(yīng)用前景好。