本發(fā)明涉及神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及一種用于原代神經(jīng)元細(xì)胞的高爾基染色方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、人類(lèi)研究大腦的神經(jīng)科學(xué)被稱(chēng)為“人類(lèi)科學(xué)最后的前沿”，要對(duì)大腦功能進(jìn)行研究，首先就要對(duì)大腦結(jié)構(gòu)進(jìn)行探索，神經(jīng)元是構(gòu)成大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的基本單元，對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像將有利于我們對(duì)大腦神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)和理解。目前對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)成像中有對(duì)組織里面的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)成像，這種方法獲得結(jié)構(gòu)，在進(jìn)行后期數(shù)據(jù)處理時(shí)，會(huì)存在結(jié)構(gòu)信息丟失的缺點(diǎn)，或者分辨率低，不能對(duì)神經(jīng)元的精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像。除此之外也有對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行完整三維神經(jīng)元結(jié)構(gòu)成像的，但是這種方法需要對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行轉(zhuǎn)染或者特異性標(biāo)記來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)構(gòu)的熒光標(biāo)記，然后通過(guò)熒光顯微鏡或超分辨率熒光顯微鏡進(jìn)行成像，但是熒光顯微鏡不能同時(shí)進(jìn)行快速、大視場(chǎng)、高分辨的成像整個(gè)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，熒光信號(hào)在長(zhǎng)時(shí)間的光照下會(huì)發(fā)生光猝滅現(xiàn)象，從而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)信息的丟失以及樣品的保存難度增加。

2、由于同步輻射x-ray具有快速，成像視野大的成像優(yōu)勢(shì)，以及擁有從低分辨率到高分辨率的多分辨率成像能力，所以同步輻射x-ray成像技術(shù)是成像神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的潛在手段。對(duì)于原代神經(jīng)元細(xì)胞的染色或標(biāo)記，目前除了轉(zhuǎn)染或特異性抗體標(biāo)記之外，還沒(méi)有染色方法或者標(biāo)記手段能對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記，同時(shí)還能用于同步輻射x-ray成像，在組織中，高爾基染色方法已經(jīng)對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)獲得良好的染色標(biāo)記，而且在同步輻射x-ray成像技術(shù)下，也能對(duì)其所染色的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像，但是在細(xì)胞層面上，高爾基染色方法還沒(méi)有獲得有效的結(jié)構(gòu)染色結(jié)果，但是基于神經(jīng)元的“嗜汞性”，仍然可以通過(guò)優(yōu)化高爾基染色方法來(lái)實(shí)現(xiàn)其對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞的染色，同時(shí)該方法在同步輻射x-ray成像技術(shù)下能進(jìn)行良好的成像效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種用于原代神經(jīng)元細(xì)胞的高爾基染色方法及其應(yīng)用，從而解決現(xiàn)有的高爾基染色方法無(wú)法對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行染色以及同步輻射x-ray成像技術(shù)無(wú)法對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行高分辨率完整三維結(jié)構(gòu)成像的問(wèn)題。

2、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種用于原代神經(jīng)元細(xì)胞的高爾基染色方法，包括以下步驟：1)從動(dòng)物腦組織中提取和培養(yǎng)原代神經(jīng)元細(xì)胞；2)使用固定液對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行固定；3)將蛋黃均勻的覆蓋在所述原代神經(jīng)元細(xì)胞的表面，反應(yīng)一段時(shí)間后，將所述蛋黃吸棄，添加配制好的高爾基染色液覆蓋到所述原代神經(jīng)元細(xì)胞表面進(jìn)行反應(yīng)，從而對(duì)固定的原代神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行染色；4)去除高爾基染色液，使用還原劑進(jìn)行反應(yīng)；以及5)光學(xué)顯微鏡成像觀察和/或同步輻射x-ray成像觀察。

4、優(yōu)選地，步驟3)中，蛋黃的作用時(shí)間為5min～60min，作用溫度為10℃～30℃。更優(yōu)選地，蛋黃的作用時(shí)間為10min～30min，作用溫度為20℃～30℃。最佳地，作用時(shí)間為15min，作用溫度為26℃。

5、優(yōu)選地，步驟3)中，所述高爾基染色液的作用時(shí)間為0.5h～72h，作用溫度為4℃～80℃。更優(yōu)選地，作用時(shí)間為6h～72h，作用溫度為10℃～30℃。最佳地，作用時(shí)間為12h，作用溫度為26℃。

6、優(yōu)選地，步驟2)中，所述固定液選自：1％～12.5％戊二醛、2％～10％多聚甲醛、5％～10％福爾馬林或10％～100％乙醇。最優(yōu)選為4％多聚甲醛。

7、優(yōu)選地，步驟2)中，所述固定液的固定時(shí)間為：10～60min。最佳地，為30min。

8、優(yōu)選地，步驟4)中，所述還原劑選自：10％～30％的氨水水溶液或1～10％的氫氧化鋰水溶液。最優(yōu)選為20％的氨水水溶液。

9、優(yōu)選地，步驟5)中，所述同步輻射x-ray成像的能量為280ev～20kev。最優(yōu)選為525ev。

10、優(yōu)選地，步驟5)中，所述同步輻射x-ray成像的分辨率高達(dá)10nm～1000nm。

11、優(yōu)選地，步驟1)中，所述動(dòng)物腦組織包括：sd鼠腦組織、c57bl/6小鼠腦組織或balb/c小鼠腦組織。最優(yōu)選為sd鼠腦組織(p0)。應(yīng)當(dāng)理解的是，這些腦組織是神經(jīng)科學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)?zāi)X組織，這些動(dòng)物易于獲得、繁殖快、壽命短、實(shí)驗(yàn)進(jìn)展更快、它們的大腦和行為與人相似，所以常用來(lái)開(kāi)展神經(jīng)科學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。本發(fā)明方法在這些常用的實(shí)驗(yàn)?zāi)X組織中具有普適性。

12、根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種高爾基染色方法在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，采用所述高爾基染色方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞快速的、高分辨率的、完整三維結(jié)構(gòu)的成像，包括光學(xué)顯微鏡成像以及同步輻射x-ray成像。

13、根據(jù)本發(fā)明所提供的方法，其工作原理為：蛋黃中富含卵磷脂，大腦中神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜和神經(jīng)纖維表面的膜的組成包含卵磷脂，將蛋黃覆蓋在經(jīng)過(guò)固定液固定的原代神經(jīng)元細(xì)胞的表面，根據(jù)相似相溶原理，蛋黃中的卵磷脂與原代神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行融合，然后再加入高爾基染色液進(jìn)行反應(yīng)，高爾基染色液在蛋黃卵磷脂的輔助下對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行染色。

14、應(yīng)當(dāng)知曉的是，在對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞染色方面，截止到目前為止，現(xiàn)有技術(shù)從未公開(kāi)過(guò)使用蛋黃對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行高爾基染色?，F(xiàn)有技術(shù)中用于原代神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記或染色的方法主要是轉(zhuǎn)染或特異性抗體標(biāo)記，并且在熒光顯微鏡下已經(jīng)獲得了較好的成像效果，但是由于熒光顯微鏡成像存在速度慢、視場(chǎng)小以及在成像過(guò)程中對(duì)熒光信號(hào)光漂白的缺點(diǎn)，使用這種標(biāo)記或染色方法研究神經(jīng)元的完整結(jié)構(gòu)還存在問(wèn)題。使用高爾基染色方法可以對(duì)組織中的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)進(jìn)行良好的染色效果，其染色結(jié)果可用于研究神經(jīng)元結(jié)構(gòu)以及該方法也是科學(xué)研究中統(tǒng)計(jì)神經(jīng)元樹(shù)突棘的經(jīng)典方法，但是在對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，該方法目前還沒(méi)有獲得良好的結(jié)果。

15、本發(fā)明首次創(chuàng)造性地在進(jìn)行高爾基染色之前添加蛋黃，對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行處理，改善了現(xiàn)有高爾基染色方法在原代神經(jīng)元細(xì)胞染色中獲得的染色結(jié)果，成功實(shí)現(xiàn)了在顯微鏡中清晰觀察到完整的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，并且經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，根據(jù)本發(fā)明提供的高爾基染色方法只對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞具有一定的染色特異性，只對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞實(shí)現(xiàn)良好的染色效果，而無(wú)法對(duì)普通細(xì)胞實(shí)現(xiàn)良好的染色效果。應(yīng)當(dāng)理解的是，高爾基染色液配方與現(xiàn)有技術(shù)相同，本發(fā)明的改進(jìn)主要集中于在進(jìn)行高爾基染色之前添加蛋黃對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行處理，利用相似相溶原理，蛋黃中的卵磷脂與原代神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行融合，然后再加入高爾基染色液進(jìn)行反應(yīng)，高爾基染色液在蛋黃卵磷脂的輔助下對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行染色。此外，本發(fā)明還對(duì)該方法進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化，對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了良好的染色效果。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：

17、1)通過(guò)在進(jìn)行高爾基染色之前添加蛋黃來(lái)改善高爾基染色方法在原代神經(jīng)元細(xì)胞染色中獲得的染色結(jié)果，通過(guò)光學(xué)顯微鏡成像即可清晰觀察到完整的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)；

18、2)應(yīng)用先進(jìn)的同步輻射x-ray成像技術(shù)進(jìn)行成像，穿透深度深，成像速度快和成像視野大，擁有從低分辨率到高分辨率的多分辨率成像能力，從而可以快速的實(shí)現(xiàn)原代神經(jīng)元細(xì)胞的高分辨率完整三維結(jié)構(gòu)的成像。根據(jù)本發(fā)明提供的方法，使用同步輻射x-ray成像技術(shù)對(duì)原代神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行完整三維結(jié)構(gòu)成像，有助于人們進(jìn)一步解析神經(jīng)元完整結(jié)構(gòu)，并理解神經(jīng)元功能，填補(bǔ)了目前神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的一大空白。

19、總之，根據(jù)本發(fā)明提供的一種用于原代神經(jīng)元細(xì)胞的高爾基染色方法，成功使用高爾基染色方法將原代神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行染色，并且在同步輻射x-ray成像技術(shù)下可以觀察到神經(jīng)元樹(shù)突和形態(tài)，為進(jìn)一步利用同步輻射x-ray研究神經(jīng)元完整三維結(jié)構(gòu)以及神經(jīng)元的完整三維精細(xì)結(jié)構(gòu)奠定了良好的研究基礎(chǔ)，這將促進(jìn)人類(lèi)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)信息交流的認(rèn)識(shí)和理解。根據(jù)本發(fā)明提供的這樣一種用于原代神經(jīng)元細(xì)胞的高爾基染色方法有望在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。