本發(fā)明為一種基于自動(dòng)化前處理裝置的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)定性定量分析方法，本發(fā)明涉及高通量臨床大樣本分析、自動(dòng)磁珠純化系統(tǒng)的運(yùn)用及蛋白前處理實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化。

背景技術(shù)：

1、蛋白質(zhì)組學(xué)是臨床大隊(duì)列疾病研究中最重要的研究內(nèi)容之一，蛋白組學(xué)不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)疾病進(jìn)程相關(guān)的各種蛋白質(zhì)的識(shí)別和定量，還包括確定蛋白質(zhì)的定位、修飾、相互反應(yīng)和最終確定它們的功能。臨床大隊(duì)列蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)于疾病治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)、疾病機(jī)理的研究、評(píng)估疾病預(yù)防效果以及預(yù)后效果具有重要意義，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和人工智能的背景下，高通量大隊(duì)列蛋白質(zhì)組學(xué)已成為當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。

2、常規(guī)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程通常包括樣品前處理、色譜分離、質(zhì)譜檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。樣品前處理是整個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程最關(guān)鍵的步驟，傳統(tǒng)樣品前處理流程依賴于多步的手工操作，不僅耗時(shí)且不可避免地存在人為誤差，成為限制蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的瓶頸之一。集成化的樣品前處理技術(shù)有利于提升蛋白質(zhì)組學(xué)分析的整體性能和靈敏度，如大連化物所研究的蛋白質(zhì)組定量集成化平臺(tái)，以集成化方式完成樣品前處理和多肽分級(jí)的全過程，顯著提升了蛋白質(zhì)組學(xué)分析的整體性能和靈敏度。高通量蛋白質(zhì)組學(xué)則對(duì)樣品前處理提出了更高要求，臨床大隊(duì)列蛋白質(zhì)組學(xué)研究的范圍包括血清血漿、組織樣本、石蠟切片等，樣本量通量大，經(jīng)常存在質(zhì)譜檢測(cè)機(jī)時(shí)不夠及由此帶來的樣本間批次效應(yīng)的問題，因此在樣本制備過程中最大程度減少樣本間誤差并且獲得穩(wěn)定重復(fù)的結(jié)果，這是目前臨床大隊(duì)列樣本組學(xué)分析所面臨的挑戰(zhàn)。

3、近十幾年來，自動(dòng)化移液工作站相繼問世，如賽默飛的自動(dòng)化磁珠提取系統(tǒng)kingfisher?flex、安捷倫高精度的bravo和精確流速控制的assay-map?bravo、貝爾曼庫爾特的biomek?nxp?自動(dòng)化工作站等，使樣品前處理逐漸實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。自動(dòng)化移液工作站借助于機(jī)械臂完成?96甚至384通道的移液操作，解放手工操作，保證高通量分析的同時(shí)，還能極大縮短前處理時(shí)間，以及減少大隊(duì)列樣品處理造成的人為誤差，大大促進(jìn)了高通量的樣品前處理技術(shù)發(fā)展。隨著高通量樣品前處理的不斷智能化，開發(fā)“零人工”操作的全自動(dòng)化樣品前處理方法成為必然的發(fā)展趨勢(shì)。

4、為了實(shí)現(xiàn)高通量蛋白質(zhì)組學(xué)前處理，目前市場(chǎng)開發(fā)了專有的ist技術(shù)，并將ist技術(shù)與安捷倫高精度的bravo自動(dòng)化平臺(tái)聯(lián)用，2h內(nèi)即可完成96個(gè)血漿樣品的前處理。市場(chǎng)還開發(fā)一種基于磁珠的樣品前處理技術(shù)-單罐固相強(qiáng)化樣品制備法（sp3），在sp3工作流程中，當(dāng)緩沖液中的有機(jī)成分增加時(shí)，表面包被羧酸鹽官能團(tuán)的親水性磁珠可以捕獲蛋白質(zhì)和肽段，然后通過使用不同的有機(jī)溶劑（乙醇?(etoh)?或乙腈?(acn)）可以洗去雜質(zhì)，有效去除離液劑、去污劑在內(nèi)的污染物，最后使用水溶液洗脫結(jié)合在磁珠上的的蛋白質(zhì)或肽，如果將sp3技術(shù)與bravo平臺(tái)相結(jié)合，可以在3.5h內(nèi)完成96個(gè)樣品的前處理，并具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。

5、現(xiàn)有的ist技術(shù)或sp3技術(shù)與自動(dòng)化平臺(tái)的聯(lián)用存在一定的局限性，例如bravo平臺(tái)僅能實(shí)現(xiàn)移液操作，而無法實(shí)現(xiàn)溫度控制；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的起始量較低（微量）時(shí)，由于損耗較大會(huì)導(dǎo)致酶解得到的肽段得率低；且當(dāng)使用ripa、sds等含去垢劑的蛋白裂解液時(shí)，無法直接去除殘留的去垢劑，從而影響質(zhì)譜端檢測(cè)結(jié)果。因此發(fā)展新的高通量技術(shù)用于蛋白質(zhì)組學(xué)定性定量分析是非常有必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明公開了一種基于自動(dòng)化前處理裝置的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)前處理方法，將sp3法與kingfisher?flex系統(tǒng)相結(jié)合，構(gòu)建磁珠純化自動(dòng)化平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)高通量臨床樣本的蛋白前處理，最多可處理96個(gè)蛋白樣本，將酶切時(shí)間從過夜縮短至3h，并且能夠有效去除影響質(zhì)譜分析的ripa、sds等去垢劑，純化肽段，從而提高蛋白鑒定的數(shù)據(jù)質(zhì)量。

2、技術(shù)方案：1）探究sp3磁珠純化體系下的肽段回收效率。

3、使用小鼠睪丸蛋白提取物作為實(shí)驗(yàn)測(cè)試樣本，分別使用尿素裂解液(50mm?tris-hcl?ph8.2，8m尿素，75mm?nacl,1mm?naf,1mm?β-甘油磷酸鈉，10mm?焦磷酸鈉，1mm正釩酸鈉)、ripa裂解液（碧云天p0013b）、6m鹽酸胍裂解組織，比較不同裂解液的裂解效果以及sp3磁珠體系下肽段的得率。

4、2）人工磁力架sp3與kingfisher?flex自動(dòng)化系統(tǒng)sp3對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

5、使用小鼠睪丸蛋白提取物作為實(shí)驗(yàn)測(cè)試樣本，使用ripa裂解液，對(duì)比相同蛋白起始量的條件下sp3-kingfisher?flex磁珠純化自動(dòng)化平臺(tái)與磁力架的蛋白捕獲效率差異。

6、3）探索不同酶切溫度、酶切時(shí)間條件下胰酶的酶切效率。

7、分別比較不同條件下胰酶對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白bsa的酶切效率，設(shè)置37℃、50℃、70℃共三個(gè)酶切溫度，縮短酶切時(shí)間至45min、60min或90min，采用1：7.14比例（每100μg蛋白中加入14μg蛋白）加入胰酶，先酶切再還原二硫鍵進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

8、4）探索37℃條件下，kingfisher?flex酶切3h的實(shí)驗(yàn)效果。

9、在kingfisher?flex系統(tǒng)中驗(yàn)證了37℃下酶切3h的酶切效果。采用小鼠睪丸蛋白提取物作為實(shí)驗(yàn)樣本，分別使用了10?μg（低）、50?μg（中）、100?μg（高）三種不同起始量的蛋白，在kingfisher?flex自動(dòng)化系統(tǒng)里設(shè)置了37℃的內(nèi)控條件，并在此溫度下驗(yàn)證肽段的酶切效率。

10、技術(shù)效果：

11、在sp3工作流程中，使用上述三種不同裂解液處理樣品得到蛋白,并在相同蛋白起始量下進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)步驟，ripa處理組的肽段得率最高50.97%，鹽酸胍的肽段得率最低，僅5.37%（表1）；從鑒定量看，ripa（鑒定到4614個(gè)蛋白）和尿素（鑒定到4582個(gè)蛋白）處理組結(jié)果相差不超過1%。按照表2，進(jìn)行人工磁力架sp3與sp3-kingfisher?flex自動(dòng)化系統(tǒng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)。人工磁力架sp3鑒定到4614個(gè)蛋白，sp3-kingfisher?flex自動(dòng)化系統(tǒng)鑒定到4625個(gè)蛋白，兩者蛋白鑒定量結(jié)果相差不超過0.5%。如表3所示，在sp3-kingfisher?flex自動(dòng)化系統(tǒng)中，使用牛血清白蛋白（bsa）作為標(biāo)品比較分析了不同溫度下（37℃，50℃，70℃）胰酶的酶切效率，可以看到溫度越高胰酶酶切效率越低，37℃胰酶酶切得到的bsa肽段覆蓋率最高；通過比較不同酶切溫度、酶切時(shí)間條件下胰酶對(duì)bsa的漏切率，可以看出37℃條件下酶切3h與37℃條件下過夜酶切效果差距最小?？紤]時(shí)間成本，因此選擇3h作為酶切時(shí)間（圖1）。從表4可以看出37℃條件下使用sp3-kingfisher?flex，對(duì)不同起始量（10?μg，50?μg，100?μg）的小鼠睪丸蛋白提取物酶切3h的實(shí)驗(yàn)效果均達(dá)到了qc（使用標(biāo)準(zhǔn)化酶切流程制備）的分析效果，蛋白鑒定數(shù)目達(dá)到了5000左右，且肽段數(shù)目達(dá)到了35000左右。

12、綜上所述，sp3-kingfisher?flex自動(dòng)化系統(tǒng)在含去垢劑ripa較多的裂解體系中，可有效去除去垢劑成分，且不影響蛋白鑒定量。在此系統(tǒng)下可以實(shí)現(xiàn)一體化酶切實(shí)驗(yàn)流程，成功將蛋白前處理時(shí)間縮短至4.5h。

13、表1?sp3磁珠純化體系下的肽段回收效率結(jié)果

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15、表?2?人工磁力架?sp3?與?kingfisher?flex?自動(dòng)化系統(tǒng)?sp3?對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果

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17、表3?不同酶切溫度、酶切時(shí)間條件下胰酶對(duì)bsa的酶切效率

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19、表4?37℃條件下，sp3-kingfisher?flex對(duì)不同起始量蛋白酶切3h的實(shí)驗(yàn)效果

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