，選 擇2-6個(gè)強(qiáng)陽性的僅有1-2個(gè)單集落的細(xì)胞孔，采用有限稀釋方法進(jìn)行克隆化。
[0057] 經(jīng)過3-4次克隆，最終篩選出分泌抗頭孢噻呋、頭孢曲松等多個(gè)頭孢菌素類抗生 素的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)染色體計(jì)數(shù)，該雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目為99. 6。申請(qǐng) 人將其命名為雜交瘤細(xì)胞4D5,并于2013年03月28日送位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的 中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為CCTCCN0:C201341。
[0058] 腹水單抗制備與鑒定：將該細(xì)胞株4D5經(jīng)腹腔注射Balb/C小鼠，生產(chǎn)單克隆抗體。 ThermoScientific公司鼠單克隆抗體快速ELISA同型檢測試劑盒的操作要求，對(duì)本發(fā)明 所得到的單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果為小鼠Igh亞型。
[0059] 實(shí)施例3芯片參數(shù)的選擇
[0060] 1)基片的選擇：分別在多聚賴氣酸玻片，正電荷玻片，晶芯尚分子基片G、酸基基 片、瓊脂糖修飾玻片上點(diǎn)〇. 5yg/mLCy3-0VA，用InnoScan700A掃描儀掃描并儲(chǔ)存數(shù)據(jù)， 結(jié)果見附圖2,從圖2-1可以看到晶芯高分子基片G的相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度最高，表明晶芯高 分子基片G對(duì)樣品的吸附性最好。從圖2-2可以看出其背景值低于醛基基片的背景值但顯 著高于其它三種基片的背景值。綜合考慮吸附性和背景值兩方面因素選擇晶芯高分子基片 G作為基片。
[0061] 2)點(diǎn)樣順序的選擇：分別按照以下四種方式：2為從右至左，從上向下；3為從左 至右，從上向下；4為從左到右，從上向下，先點(diǎn)完第一排反應(yīng)區(qū)域，再點(diǎn)第二排反應(yīng)區(qū)域；5 為從右到左，從上向下，先點(diǎn)完第一排反應(yīng)區(qū)域，再點(diǎn)第二排反應(yīng)區(qū)域，各點(diǎn)樣方式的示意 圖見附圖3,1為最終點(diǎn)樣效果。結(jié)果顯示，相對(duì)于其他方式，方式3的相對(duì)熒光信號(hào)值基本 處于穩(wěn)定狀態(tài)，變異系數(shù)最?。?.96% )，說明該方式點(diǎn)出的點(diǎn)均一性較好，所以選用方式3 作為最優(yōu)的芯片點(diǎn)樣方式。
[0062] 3)點(diǎn)樣稀釋液的選擇：選用pH7. 4磷酸鹽緩沖液（PBS)、pH9. 6碳酸鹽緩沖 溶液（CBS)、pH7. 4Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBS)、含10 % (重量百分比，下同）甘油的 pH7. 4PBS(PBS+10 %G)、含 10 % 甘油的pH9. 6CBS(CBS+10 %G)、含 10 % 甘油的pH7. 4 TBS(TBS+10%G)分別作為點(diǎn)樣液配制10yg/mL頭孢包被原溶液進(jìn)行點(diǎn)樣，以卵白蛋白 (OVA)作為陰性對(duì)照，以Cy3標(biāo)記的卵白蛋白（Cy3-0VA)作為陽性對(duì)照，制備芯片，結(jié)果 見附圖4-1，可以看出用CBS+10%G、CBS作為點(diǎn)樣液的相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯高于其他 點(diǎn)樣液的，所以初步選用CBS為晶芯高分子基片G的點(diǎn)樣溶液；對(duì)CBS的pH進(jìn)行了優(yōu)化， 結(jié)果如附圖4-2所示，可以顯示隨著CBSpH值的增大，熒光信號(hào)強(qiáng)度呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，說 明用pH9. 16的CBS作為點(diǎn)樣液比較好；考察了不同表面活性劑45%甘油（glycerine)、 0.0025 % 酷蛋白（Casein)、0? 5 % 海藻糖（Trehalose)、1.5 % 甘露醇（Mannitol)、0? 01 % 曲拉通X-100(tritonX-100)、0. 05%吐溫-20 (tween-20)對(duì)固定效果的影響，OVA作為陰 性對(duì)照，Cy3_0VA作為陽性對(duì)照，結(jié)果見附圖4-3,可以看出用含0. 5%Trehalose、不加表 面活性劑和含1. 5%Mannitol的相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度基本差不多，都比其他的高，所以選用 pH9. 16CBS作為點(diǎn)樣液，同時(shí)考慮到低濃度甘油（5-10% )可以減少樣品點(diǎn)的揮發(fā)，穩(wěn)定點(diǎn) 形，所以選用含5%甘油的pH9. 16CBS作為點(diǎn)樣液。
[0063] 4)固定時(shí)間的選擇：分別將固定時(shí)間設(shè)置為0. 5、l、2、4、6h，根據(jù)相對(duì)焚光信號(hào)強(qiáng) 度篩出合適的固定時(shí)間，結(jié)果見附圖6-1，可以看出隨著固定時(shí)間的延長，相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng) 度急劇下降，所以選用0. 5h作為固定時(shí)間。
[0064] 5)封閉液的選擇：選用2% (重量百分比，下同）卵清蛋白（OVA)、2%牛血清白 蛋白（BSA)、25%胎牛血清（FCS)分別作為封閉液進(jìn)行篩選，結(jié)果見附圖4-4,可以看出2% BSA為封閉液時(shí)相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度高于其他兩個(gè)，所以選用2%BSA為封閉液。
[0065] 6)封閉時(shí)間的選擇：分別將封閉時(shí)間設(shè)置為0.5、1、1. 5、2h，根據(jù)相對(duì)焚光信號(hào)強(qiáng) 度篩選出一個(gè)在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到需要的信號(hào)強(qiáng)度的封閉時(shí)間。結(jié)果見附圖6-2,可以看出隨 著封閉時(shí)間的延長，其相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸下降，所以選用〇. 5h作為封閉時(shí)間。
[0066] 7)抗體稀釋液的選擇：用pH7. 4PBS，pH7. 4TBS，pH9. 6CBS三種常用緩沖溶液分 別作為一抗和二抗稀釋液，結(jié)果見附圖5-1和2,可知pH7. 4PBS作為抗體稀釋液時(shí)的相對(duì) 熒光信號(hào)強(qiáng)度最高，說明在PH7.4PBS的環(huán)境下抗原抗體反應(yīng)較好，所以最終選pH7.4PBS 作為抗體稀釋液。
[0067] 8)反應(yīng)溫度的選擇：分別在4、25、37°C下進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，結(jié)果見附圖5-3,可 以明顯看出在37°C抗原抗體反應(yīng)才能進(jìn)行得較徹底，所以選取37°C作為反應(yīng)溫度。
[0068] 9)反應(yīng)時(shí)間的選擇：分別將抗原抗體反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為0.5、1、1. 5、2、3h，根據(jù)相對(duì) 熒光信號(hào)強(qiáng)度篩出合適的反應(yīng)時(shí)間。附圖6-3是一抗反應(yīng)時(shí)間測優(yōu)化結(jié)果，可知一抗反應(yīng) 時(shí)間為1. 5h時(shí)其信號(hào)強(qiáng)度較高，說明抗原抗體反應(yīng)在1. 5h時(shí)達(dá)到最佳狀態(tài)，考慮到芯片作 為一種快速檢測方法，選用〇. 5h作為一抗反應(yīng)時(shí)間，并將通過點(diǎn)樣濃度和抗體稀釋度優(yōu)化 相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度。附圖6-4是二抗反應(yīng)時(shí)間測優(yōu)化結(jié)果，可以看出相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度大 致隨著二抗反應(yīng)時(shí)間的延長而增強(qiáng)，但是增強(qiáng)地不是很明顯，所以選0. 5h作為二抗反應(yīng)時(shí) 間。
[0069] 實(shí)施例4抗體芯片的制備
[0070] 1)考核所用的兩種頭孢類包被原和單克隆抗體
[0071] 按ELS1A操作流程測定抗體的效價(jià)，將包被原用碳酸鹽緩沖液稀釋成一系列工作 濃度，4°C包被過夜。甩出包被液，每孔加250yL洗滌液，靜置30秒后，甩出洗滌液，拍干，重 復(fù)洗滌3次，拍干。每孔加250yL封閉液，置37°C濕盒封閉lh。甩出封閉液后洗滌3次， 拍干。將抗體稀釋成 1: 1〇〇、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800,每孔加 入50yLPBS，50yL稀釋一系列濃度的抗體，37°C濕盒孵育30min。甩出孔內(nèi)液體后洗滌3 次，拍干。將HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗用緩沖液稀釋成工作濃度1:5000,100yL/孔，37°C濕盒 孵育30min。甩出孔內(nèi)液體后洗滌3次，拍干。加底物液100yL/孔，37°C濕盒孵育15min。 每孔加50yL終止液，用酶標(biāo)儀測0D45(IM值。以〃0〃孔0D45(|M值接近2. 0,對(duì)應(yīng)的抗體稀 釋度定義為抗體的效價(jià)。
[0072] 間接競爭ELISA法與間接ELISA法的程序基本相同，只是在加入抗體時(shí)應(yīng)當(dāng)先 加入相應(yīng)的藥物50yL，然后再加入稀釋的抗體50yL，37°C濕盒孵育30min。獲得頭孢氨 芐的IC5(I為2yg/L，線性范圍為0. 5-8yg/L，頭孢曲松的1C5(|為2. 91yg/L，線性范圍為 0. 625-10yg/L，靈敏度完全達(dá)到國家獸藥殘留檢測方法要求，也很適合制備抗體芯片。
[0073] 2)包被原和抗體濃度的優(yōu)化
[0074] 包被原濃度的選擇：將頭孢氨芐包被原的濃度從左到右設(shè)置為0.75、1. 5、3、 6、12、24yg/mL6 個(gè)濃度，從右到左依次加 1:64000、1:32000、1:16000、1:8000、1:4000、 1:2000的頭孢氨節(jié)單克隆抗體進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)頭孢氨節(jié)包被原為6yg/mL時(shí)，抗體 稀釋度1:4000時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度在1. 5萬左右，與其它信號(hào)強(qiáng)度相差較大，所以選6 y g/mL為 頭孢氨芐包被原溶液的濃度。
[0075] 最佳抗體稀釋度的確定：以選定的濃度制備頭孢氨節(jié)抗體芯片，自上而下添加 1:2000-1:64000頭孢氨芐單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著抗體稀釋度的增加，相對(duì)熒 光信號(hào)強(qiáng)度明顯下降，初步確定抗體稀釋度為1:2000、1:4000、1:8000,然后在三個(gè)抗體稀 釋度下做間接競爭反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗體稀釋為1:4000時(shí)抑制不明顯，應(yīng)該是頭孢抗體過量 造成的；抗體稀釋為1:16000時(shí)抑制效果較明顯，但整體信號(hào)強(qiáng)度較弱；頭孢氨芐抗體稀釋 為1:800時(shí)抑制效果一般，得到的IC5(I為3