. 36yg/L，比ELISA方法IC5(|2yg/L高，所以將 最佳頭孢氨芐單克隆抗體的稀釋度設(shè)置為1:10000。
[0076] 同理優(yōu)化了頭孢噻呋包被原和抗體濃度，結(jié)果得到最佳頭孢噻呋包被原溶液的濃 度為32yg/mL，最佳頭孢噻呋單克隆抗體的稀釋度為1:12000。
[0077] 3)點(diǎn)制頭孢類(lèi)抗體芯片
[0078] 將載體用圍欄分成12(2X6)個(gè)反應(yīng)區(qū)域如附圖7所示。分別用AD3200點(diǎn)樣儀把 1 %OVA溶液、6yg/mL頭孢氨芐包被原溶液、32yg/mL頭孢噻呋包被原溶液、Cy3-0VA溶液 在每個(gè)區(qū)域進(jìn)行點(diǎn)樣，20nL/點(diǎn)，每個(gè)區(qū)域形成1個(gè)3X4的點(diǎn)陣。將點(diǎn)樣后的芯片置于密 閉的濕盒中，置于37°C恒溫箱中固定0.5h。將芯片放入含PBST(量以淹沒(méi)玻片為準(zhǔn)）洗滌 管中，用搖床振搖/手動(dòng)搖洗2min，重復(fù)三次，再放入含ddH20 (以淹沒(méi)玻片為準(zhǔn)）洗滌管中 用搖床振搖9/手動(dòng)搖洗2min，重復(fù)三次，最后將玻片以2000r/min轉(zhuǎn)速4°C離心lmin。然 后加入20yL/孔2%BSA封閉液，放入密閉的濕盒中，置于37°C恒溫箱封閉0. 5h，洗滌后， 37°C烘干5min，抽真空封裝存于4°C備用。
[0079] 實(shí)施例5頭孢類(lèi)抗體芯片的性能考核
[0080] 5. 1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0081] 配制頭孢類(lèi)混合抗體（1:10000頭孢氨芐抗體和1:12000頭孢噻呋抗體）。用PBS 將頭孢氨芐和頭孢曲松標(biāo)準(zhǔn)品配制成〇、〇. 625、1. 25、2. 5、5、10yg/L等6個(gè)濃度。分別將 10yL混合藥物和10yL混合抗體加到芯片上，反應(yīng)0. 5小時(shí)，使固定的人工抗原充分與樣 品中的藥物共同競(jìng)爭(zhēng)特異性抗體，洗滌，離心甩干。加入20yL1:200稀釋的Cy3標(biāo)記羊抗 小鼠IgG，反應(yīng)0.5小時(shí)，洗滌，離心甩干，將甩干的芯片使用InnoScan700A掃描儀進(jìn)行掃 描，用Mapix分析軟件進(jìn)行分析。以競(jìng)爭(zhēng)物濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的抑制率F/匕為 縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)附圖8得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)，根據(jù)回歸方程計(jì)算IC5(I，得到頭 孢氨芐的IC5Q為1. 79yg/L，線性范圍為0? 625-10yg/L，頭孢曲松的IC5Q為2. 52yg/L，線 性范圍為0. 625-10yg/L。相同方法，重復(fù)測(cè)定5批，求出IC5Q平均值，并計(jì)算片內(nèi)與片間 變異系數(shù)，得到片內(nèi)片間變異系數(shù)均小于15%，說(shuō)明重復(fù)性良好。
[0082] 5. 2靈敏度
[0083] 測(cè)定20份0 y g/L競(jìng)爭(zhēng)物標(biāo)準(zhǔn)溶液，將F值分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算對(duì)應(yīng) 濃度值，求20份測(cè)定濃度值的平均值(I)和標(biāo)準(zhǔn)差（SD)。根據(jù)公式Z=叉+3xSD計(jì)算Z值， 作為抗體芯片檢測(cè)方法靈敏度的判定指標(biāo)。得到頭孢類(lèi)抗體芯片檢測(cè)方法頭孢氨芐的靈敏 度為0. 47yg/L，頭孢曲松的靈敏度為0. 73yg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于最大殘留限量。
[0084] 5. 3特異性
[0085] 分別將頭孢類(lèi)及其類(lèi)似物標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋成一系列濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IC5(I 值，與標(biāo)準(zhǔn)品IC5(I值對(duì)比得到交叉反應(yīng)率。結(jié)果見(jiàn)表1，該抗體芯片能夠很好地識(shí)別頭孢氨 芐、頭孢羥氨芐、頭孢拉定、頭孢曲松、頭孢噻呋、脫呋喃甲酰頭孢噻呋，對(duì)頭孢噻肟和頭孢 喹肟也有一定識(shí)別。
[0086] 表1頭孢類(lèi)體芯片的交叉反應(yīng)率結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)食品中頭抱類(lèi)抗生素殘留的抗體巧片試劑盒，包括巧片、抗體、切3標(biāo) 記的二抗、提取試劑，其特征在于：所述抗體由頭抱氨節(jié)單克隆抗體和頭抱唾快單克隆抗 體組成，所述頭抱氨節(jié)單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC N0:C201340雜交瘤細(xì)胞3A6所分 泌的，能識(shí)別頭抱氨節(jié)、頭抱哲氨節(jié)和頭抱拉定；所述頭抱唾快單克隆抗體是由保藏號(hào)為 CCTCC N0:C201341雜交瘤細(xì)胞4D5所分泌的，能識(shí)別頭抱唾快，脫快喃甲酷頭抱唾快、頭抱 曲松、頭抱唾目虧及頭抱嗟目虧，所述巧片固定了頭抱氨節(jié)包被原和頭抱唾快包被原，所述頭抱 氨節(jié)包被原是頭抱氨節(jié)與卵清白蛋白偶聯(lián)物，所述頭抱唾快包被原是頭抱唾快與卵清白蛋 白偶聯(lián)物。
2. 如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)食品中頭抱類(lèi)抗生素殘留的抗體巧片試劑盒，其特征 在于所述巧片按如下方法制備；W晶巧高分子基片G作為基片，用圍欄將基片分成兩排共 12個(gè)反應(yīng)區(qū)域，每個(gè)反應(yīng)區(qū)域設(shè)四排=縱共12個(gè)微陣列，將頭抱氨節(jié)包被原溶液、頭抱唾 快包被原溶液W及兩種對(duì)照溶液一一卵清白蛋白溶液和切3標(biāo)記的卵清白蛋白溶液分別點(diǎn) 樣在其中一排微陣列上，點(diǎn)樣完成后固定0.化，用2%牛血清白蛋白溶液封閉0.化。
3. 如權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)食品中頭抱類(lèi)抗生素殘留的抗體巧片試劑盒，其特 征在于；所述頭抱氨節(jié)包被原溶液的濃度為6 y g/mU所述頭抱唾快包被原溶液的濃度 為32 y g/mU所述頭抱氨節(jié)包被原溶液和頭抱唾快包被原溶液的溶劑是含有5 %甘油的 pH9. 16碳酸鹽緩沖液。
4. 如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)食品中頭抱類(lèi)抗生素殘留的抗體巧片試劑盒，其特征 在于；所述的切3標(biāo)記的二抗是切3標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠抗體。
5. 如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)食品中頭抱類(lèi)抗生素殘留的抗體巧片試劑盒，其特征 在于所述提取試劑是按如下方法配制的；準(zhǔn)確吸取甲醇lOmU超純水稀釋?zhuān)ㄈ葜羖OOmL。
6. 權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的抗體巧片試劑盒在檢測(cè)食品中頭抱類(lèi)抗生素殘留的 應(yīng)用。
7. -種檢測(cè)食品中頭抱類(lèi)抗生素殘留的抗體巧片方法，其特征在于包括W下步驟： 1) 樣品前處理；樣品勻漿后加入提取試劑提??； 2) 將樣品液和稀釋好的抗體混合后加入到固定了頭抱氨節(jié)包被原溶液、頭抱唾快包 被原溶液、W及對(duì)照溶液一一卵清白蛋白溶液和切3標(biāo)記的卵清白蛋白溶液的巧片上，于 37°C反應(yīng)0.化，洗漆3次，甩干； 3) 將切3標(biāo)記的二抗加到巧片，于37°C反應(yīng)0.化，洗漆3次，甩干； 4) 用InnoScan 700A掃描儀對(duì)巧片進(jìn)行掃描，與卵清白蛋白溶液和切3標(biāo)記的卵清白 蛋白溶液進(jìn)行對(duì)照，用Mapix分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析， 所述抗體由頭抱氨節(jié)單克隆抗體和頭抱唾快單克隆抗體組成，所述頭抱氨節(jié)單克隆抗 體是由保藏號(hào)為CCTCC N0:C201340雜交瘤細(xì)胞3A6所分泌的，能識(shí)別頭抱氨節(jié)、頭抱哲氨 節(jié)和頭抱拉定；所述頭抱唾快單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC N0:C201341雜交瘤細(xì)胞4D5 所分泌的，能識(shí)別頭抱唾快，脫快喃甲酷頭抱唾快、頭抱曲松、頭抱唾朽及頭抱嗟朽； 所述頭抱氨節(jié)包被原是頭抱氨節(jié)與卵清白蛋白偶聯(lián)物，所述頭抱唾快包被原是頭抱唾 快與卵清白蛋白偶聯(lián)物； 所述切3標(biāo)記的二抗是切3標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠抗體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于檢測(cè)食品中頭抱類(lèi)抗生素殘留的抗體巧片方法，其特征 在于；所述提取試劑是按如下方法配制的；準(zhǔn)確吸取甲醇lOmU超純水稀釋?zhuān)ㄈ葜羖OOmL。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于檢測(cè)食品中頭抱類(lèi)抗生素殘留的抗體巧片方法，其特 征在于：所述抗體是用抑7. 4的磯酸鹽緩沖液稀釋的，其中頭抱氨節(jié)單克隆抗體的稀釋度 為1:10000,頭抱唾快單克隆抗體的稀釋度為1:12000 ;所述頭抱氨節(jié)包被原溶液的濃度為 6 y g/mU所述頭抱唾快包被原溶液的濃度為32 y g/mU所述頭抱氨節(jié)包被原溶液和頭抱唾 快包被原溶液的溶劑是含有5%甘油的pH9. 16碳酸鹽緩沖液。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)食品中頭孢類(lèi)抗生素殘留的抗體芯片試劑盒，屬藥物殘留檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括芯片、抗體、Cy3標(biāo)記的二抗、提取試劑，所述抗體由頭孢氨芐單克隆抗體和頭孢噻呋單克隆抗體組成，所述頭孢氨芐單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC NO:C201340雜交瘤細(xì)胞3A6所分泌的；所述頭孢噻呋單克隆抗體是由保藏號(hào)為CCTCC NO:C201341雜交瘤細(xì)胞4D5所分泌的，所述芯片固定了頭孢氨芐包被原和頭孢噻呋包被原。本發(fā)明還公開(kāi)了一種用于檢測(cè)食品中頭孢類(lèi)抗生素殘留的抗體芯片方法，該方法可以同時(shí)檢測(cè)8種頭孢類(lèi)藥物，具有準(zhǔn)確度高，精密度好、效率高等特點(diǎn)。CCTCC NO: C20134120130328 CCTCC NO: C20134020130328
【IPC分類(lèi)】G01N33-02, G01N33-577
【公開(kāi)號(hào)】CN104535730
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410830203
【發(fā)明人】袁宗輝, 彭大鵬, 魏娜娜, 王玉蓮, 陳冬梅, 陶燕飛, 劉振利
【申請(qǐng)人】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月26日