免疫學(xué)測(cè)定的靈敏度增強(qiáng)方法或避免血紅蛋白影響的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】免疫學(xué)測(cè)定的靈敏度増強(qiáng)方法或避免血紅蛋白影響的方法
[0001] 本申請(qǐng)是中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?00980125714. 2的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)（原申請(qǐng)的 發(fā)明名稱(chēng)為"免疫學(xué)測(cè)定的靈敏度增強(qiáng)方法或避免血紅蛋白影響的方法"，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日 為2009年7月3日）。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)測(cè)定的靈敏度增強(qiáng)方法或避免血紅蛋白影響的方法以及用于 這些方法的試劑。
【背景技術(shù)】
[0003] 近年，為了測(cè)定生物體試樣中的微量物質(zhì)，廣泛應(yīng)用了利用免疫反應(yīng)的測(cè)定方法。 作為免疫學(xué)測(cè)定方法，有RIA法、EIA法、免疫比濁法、膠乳凝集法、金屬膠體凝集法、免疫色 譜法等多種方法。其中，膠乳凝集法、金屬膠體凝集法因?yàn)椴贿M(jìn)行反應(yīng)液的分離、清洗，所以 適合于自動(dòng)化而被通用。對(duì)于免疫學(xué)測(cè)定，通常，根據(jù)測(cè)定的生物體試樣中的被測(cè)定物質(zhì)濃 度而采用不同方法。膠乳凝集法、金屬膠體凝集法與免疫比濁法相比，能夠進(jìn)行微量物質(zhì)的 測(cè)定，但是不能夠如RIA法、EIA法那樣進(jìn)行微量物質(zhì)的測(cè)定。對(duì)于任何免疫學(xué)測(cè)定方法都 希望反應(yīng)體系的微量化、測(cè)定時(shí)間的縮短，所以使測(cè)定靈敏度增強(qiáng)是重要的課題。
[0004] 作為增強(qiáng)測(cè)定靈敏度的技術(shù)，已知有將聚乙二醇或葡聚糖等水溶性多糖類(lèi)添加到 反應(yīng)體系中的技術(shù)（專(zhuān)利文獻(xiàn)1和2)。但是，這些添加劑因?yàn)橛蟹肿恿糠植肌⒉皇菃我换?物，所以存在得不到穩(wěn)定的靈敏度增強(qiáng)效果等缺點(diǎn)。
[0005] 另外，對(duì)于任何免疫學(xué)測(cè)定方法都存在如下問(wèn)題，即，除目的抗原抗體反應(yīng)以外， 由于與試樣中的各種夾雜物質(zhì)發(fā)生非特異反應(yīng)而發(fā)生凝集、吸附，測(cè)定精度下降。尤其是使 用血漿等來(lái)自生物體的試樣，當(dāng)該試樣中含有來(lái)自紅血球的血紅蛋白時(shí)，有時(shí)血紅蛋白對(duì) 免疫學(xué)測(cè)定的測(cè)定值產(chǎn)生影響。但是，溶血的程度隨檢測(cè)物而不同，所以不能得到正確的測(cè) 定值，因此需要謀求避免其影響的方法。
[0006] 以往，作為避免血紅蛋白的影響的方法，提出了添加表面活性劑的方法（專(zhuān)利文 獻(xiàn)3)等。但是，在免疫學(xué)測(cè)定方法中，添加表面活性劑的方法存在測(cè)定靈敏度下降、不能精 度良好地測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的問(wèn)題。
[0007] 另外，專(zhuān)利文獻(xiàn)4中記載了，在使用抗人CRP兔血清對(duì)人血清中的CRP進(jìn)行免疫學(xué) 測(cè)定的方法中，通過(guò)添加多元酚，可以抑制因補(bǔ)體成分所致的非特異反應(yīng)，作為具體例，記 載了通過(guò)添加5mM硫酸杯[6]芳烴能夠抑制因補(bǔ)體等所導(dǎo)致的非特異反應(yīng)。但是，在該專(zhuān) 利文獻(xiàn)4中，僅記載了將人血清作為試樣、使用抗人CRP兔血清測(cè)定CRP時(shí)杯芳烴類(lèi)對(duì)補(bǔ)體 影響的作用，但是對(duì)于杯芳烴類(lèi)對(duì)靈敏度起怎樣的作用、還有對(duì)血紅蛋白影響的效果完全 沒(méi)有記載。而且，對(duì)于使用對(duì)抗原的抗體、或抗體的抗原進(jìn)行了敏化的不溶性載體（例如膠 乳粒子）測(cè)定作為測(cè)定對(duì)象的該抗原或該抗體的方法，沒(méi)有任何記載。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009] 專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0010] 專(zhuān)利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)昭58-047256號(hào)公報(bào)
[0011] 專(zhuān)利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)昭59-220646號(hào)公報(bào)
[0012] 專(zhuān)利文獻(xiàn)3:日本特開(kāi)昭60-168050號(hào)公報(bào)
[0013] 專(zhuān)利文獻(xiàn)4:日本特開(kāi)2000-329764號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的課題在于提供對(duì)測(cè)定對(duì)象進(jìn)行免疫學(xué)測(cè)定中的靈敏度增強(qiáng)方法以及靈 敏度得到增強(qiáng)的免疫學(xué)測(cè)定用試劑。
[0015]另外，本發(fā)明的課題在于提供在使用免疫學(xué)測(cè)定法測(cè)定血漿等來(lái)自生物體的試樣 中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的體系中避免血紅蛋白影響的方法。
[0016] 因此，本發(fā)明人等對(duì)免疫反應(yīng)中的增強(qiáng)測(cè)定靈敏度的方法進(jìn)行了研宄，結(jié)果完全 意外地發(fā)現(xiàn)了，在反應(yīng)體系中添加杯芳烴類(lèi)等大環(huán)化合物時(shí)，如果反應(yīng)體系中的最終濃度 為5mM則空白試劑值變得異常，盡管沒(méi)有觀察到測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的濃度依賴(lài)性的測(cè)定靈敏度 增強(qiáng)，但是當(dāng)反應(yīng)體系中的最終濃度為0. 005?4mM這樣的低濃度時(shí)，觀察到測(cè)定靈敏度的 增強(qiáng)，因此即使使用測(cè)定對(duì)象物質(zhì)濃度是低濃度的試樣，也能夠正確地進(jìn)行測(cè)定。另外發(fā)現(xiàn) 了，當(dāng)向反應(yīng)體系中添加大環(huán)化合物時(shí)，可以避免試樣中的血紅蛋白的影響，即使測(cè)定對(duì)象 物質(zhì)濃度是低濃度也能夠正確地測(cè)定。
[0017] 即，本發(fā)明提供一種免疫學(xué)測(cè)定的靈敏度增強(qiáng)方法或避免血紅蛋白影響的方法， 其是應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)測(cè)定生物體試樣中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的免疫學(xué)測(cè)定方法，其特征在 于，在大環(huán)化合物的存在下進(jìn)行反應(yīng)。
[0018] 另外，本發(fā)明提供一種免疫學(xué)測(cè)定用試劑，其在應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)測(cè)定試樣中的 測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的免疫學(xué)測(cè)定方法中使用，其特征在于，含有以大環(huán)化合物為主成分的靈敏 度增強(qiáng)劑或血紅蛋白影響避免劑。
[0019] 依照本發(fā)明的方法，因?yàn)樵鰪?qiáng)了測(cè)定對(duì)象物質(zhì)的測(cè)定靈敏度，所以即使使用測(cè)定 對(duì)象物質(zhì)濃度低的試樣也可以進(jìn)行正確的測(cè)定。另外，依照本發(fā)明的免疫學(xué)測(cè)定方法，因?yàn)?可以避免來(lái)自生物體的試樣中的血紅蛋白的影響，所以即使該試樣含有血紅蛋白，也可以 進(jìn)行正確的測(cè)定。另外，因?yàn)樯鲜龃蟓h(huán)化合物（例如杯芳烴類(lèi)或環(huán)糊精等）可以以單一化 合物而獲得，所以可得到?jīng)]有批間差異的、穩(wěn)定的測(cè)定精度提高效果。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 本發(fā)明的方法中的試樣，優(yōu)選生物體試樣，特別優(yōu)選可能存在紅血球或來(lái)自紅血 球的血紅蛋白的來(lái)自生物體的試樣。例如，可舉出脊髓液、淚液、組織液、血液、血漿、以及血 清等。其中，來(lái)自血液的試樣，即血液、血漿、以及血清等，大多含有血紅蛋白，特別有用。
[0021] 在本發(fā)明中，作為免疫學(xué)測(cè)定方法，只要是應(yīng)用測(cè)定對(duì)象物質(zhì)和能夠與該對(duì)象物 質(zhì)發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的物質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)測(cè)定方法就沒(méi)有特別限制。例如，可 舉出免疫擴(kuò)撒法（SRID法）、免疫比濁法、紅血球凝集法、膠乳凝集法或金屬膠體凝集法、 RIA法、EIA法。其中，膠乳凝集法或金屬膠體凝集法，測(cè)定靈敏度高、適合于通用的自動(dòng)分 析裝置等、也適合自動(dòng)化，因此優(yōu)選。特別地，更優(yōu)選使用對(duì)抗體進(jìn)行了敏化的不溶性載體 的方法。
[0022] 作為該不溶性載體，可舉出有機(jī)高分子粒子、無(wú)機(jī)物質(zhì)粒子、紅血球等。作為有機(jī) 高分子粒子，可舉出不溶性瓊脂糖、纖維素、不溶性葡聚糖等粒子，優(yōu)選膠乳粒子。作為該膠 乳粒子，例如可舉出聚苯乙烯、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯_(甲基）丙烯酸縮水甘 油酯共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸鹽共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁 二烯苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚乙酸乙烯酯丙烯酸酯等粒子。另外，也可 以根據(jù)需要使用各種改性膠乳（例如，羧酸改性膠乳）等。使用的膠乳粒子的平均粒徑，通 過(guò)測(cè)定機(jī)器等適當(dāng)選擇0. 05?0. 50ym。作為無(wú)機(jī)物質(zhì)粒子可舉出二氧化娃、氧化錯(cuò)等。
[0023] 作為本發(fā)明的方法中的測(cè)定對(duì)象物質(zhì)，只要是免疫學(xué)測(cè)定方法中測(cè)定的物質(zhì)則沒(méi) 有特別限定，可舉出各種物質(zhì)，例如抗原、半抗原、抗體、激素、藥物等。其中，優(yōu)選將抗原作 為測(cè)定對(duì)象物質(zhì)，更優(yōu)選蛋白抗原。具體地說(shuō)，例如可舉出CRP、纖維蛋白和纖維蛋白原分 解物、D二聚體、可溶性纖維蛋白（SF)、脂蛋白（a)(Lp(a))、基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)、前列 腺特異抗原（PSA)、IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、抗鏈球菌溶血素0、類(lèi)風(fēng)濕因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、結(jié)合 珠蛋白、a1-抗胰蛋白酶、a1-酸性糖蛋白、a2-巨球蛋白、血液結(jié)合素、抗凝血酶-III、 a-甲胎蛋白、CEA(癌胚抗原）、鐵蛋白、HBs-Ag(B型肝炎表面抗原）、Anti-HBs(抗B型肝 炎表面抗體）、fffie-Ag(B型肝炎e抗原）、Anti-HBe(抗B型肝炎e抗體）、Anti-HBc(抗B 型肝炎核心抗體）等。其中，優(yōu)選CRP、纖維蛋白和纖維蛋白原分解物、D二聚體、SF、Lp(a)、 MMP-3、PSA等。但是，并不限定于這些。
[0024] 作為能和上述測(cè)定對(duì)象物質(zhì)發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的物質(zhì)（以下，稱(chēng)作免疫反應(yīng)物 質(zhì)），當(dāng)測(cè)定對(duì)象物質(zhì)是抗原或半抗原等時(shí)，則使用其抗體，當(dāng)測(cè)定對(duì)象物是抗體時(shí)，則使用 其抗原。作為免疫反應(yīng)物質(zhì)的抗原和抗體可以通過(guò)慣用方法制備。另外，抗體可以是多克 隆抗體、單克隆抗體中的任何一種，另外，也可以是Fab片段、F(ab'）2片段等。
[0025] 本發(fā)明所使用的大環(huán)化合物是能夠在其分子內(nèi)孔嵌入金屬離子或無(wú)機(jī)物、有機(jī)物 等的功能分子。作為該大環(huán)化合物，沒(méi)有特別限定，可以使用各種物質(zhì)。例如可使用杯芳烴 類(lèi)、環(huán)糊精、冠醚等。另外，也可以使用它們的衍生物或修飾物。其中，優(yōu)選具有容易包合疏 水性分子的空孔、具有至少4殘基的親水性官能團(tuán)的物質(zhì)。作為該親水性官能團(tuán)，可舉出羥 基、羧基、磺酸基等。作為特別優(yōu)選的該大環(huán)化合物，例如可舉出杯芳烴類(lèi)、環(huán)糊精等。
[0026] 杯芳烴類(lèi)是以苯酚為基本骨架，用亞甲基將3?20分子、優(yōu)選4?8分子的苯酚聚 合成環(huán)狀的環(huán)狀低聚物。作為杯芳烴類(lèi)沒(méi)有特別限制，可以使用各種物質(zhì)。例如，可舉出杯 [4]