葡萄酒中吡唑類殺菌劑的固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[oocn] 本發(fā)明屬于食品檢測領(lǐng)域，涉及固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/M巧，具 體是指一種葡萄酒中戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺等5種化哇 類殺菌劑的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄酒生產(chǎn)主要原料的葡萄在田間管理過程中，為防止病蟲害發(fā)生，通常會噴施 一定量的農(nóng)藥，有些農(nóng)藥在葡萄酒生產(chǎn)發(fā)酵過程中不易去除分解，會不同程度地殘留在葡 萄酒中，給飲用者健康帶來潛在的危害。
[0003] 殺菌劑是用于防治由各種病原微生物引起的植物病害的一類低毒農(nóng)藥，主要指殺 真菌劑。目前，化哇類化合物因其具有高效、低毒W(wǎng)及化哇環(huán)上取代基可多方位變換等優(yōu) 勢，已成為新型殺菌劑開發(fā)的熱點(diǎn)之一。該些殺菌劑具有特殊的作用方式，并有多種生物活 性。例如，哇菌胺醋（Pyraclostrobin)為甲氧基丙帰酸醋類線粒體電子傳遞抑制劑，顯示 了對許多植物真菌廣泛的抑制作用。而巧化菌胺（化rametpyr)，屬于玻巧酸脫氨酶抑制劑 (SDHI)，可W抑制真菌呼吸的復(fù)合II玻巧酸脫氨酶。近些年來，多種化哇類殺菌劑被越來 越廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的植物病害控制，如谷物，蔬菜和水果等。
[0004] 因此，食品產(chǎn)品中出現(xiàn)殺菌劑殘留物并不意外。該些化哇類殺菌劑雖然對環(huán)境相 對友好，但若在農(nóng)產(chǎn)品中使用不當(dāng)，會造成其在食品中的高殘留問題，威脅人體健康。因此， 建立準(zhǔn)確、可靠地測定葡萄酒中戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺等 5種化哇類殺菌劑的含量非常重要。
[0005] 分析方法可分為定性分析、定量分析和定性定量分析技術(shù)。定量分析一般采用色 譜技術(shù)和色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，色譜技術(shù)有氣相色譜和氣相色譜等方法，色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法；定性定量分析則要兼具兩種技術(shù)為 一體，檢測結(jié)果要同時提供目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)信息和數(shù)量信息，根據(jù)歐盟委員會非強(qiáng)制執(zhí)行法 案2002/657/EC的規(guī)定，對禁用藥物進(jìn)行確證檢測的方法必須能提供結(jié)構(gòu)方面的信息，且 要達(dá)到該法案規(guī)定的4個確證點(diǎn)。
[0006] 目前，由于國內(nèi)外無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或文獻(xiàn)可循，因此，有必要對葡萄酒尤其是葡萄酒中 的戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺等5種化哇類殺菌劑的檢測方 法進(jìn)行研究，從而對葡萄酒中化哇類殺菌劑進(jìn)行監(jiān)測，同時為國內(nèi)葡萄酒企業(yè)出口到歐盟 等地區(qū)時，能出具符合歐盟委員會非強(qiáng)制執(zhí)行法案2002/657/EC的規(guī)定的檢測數(shù)據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種葡萄酒中化哇類殺菌劑的固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì) 譜檢測方法，該方法結(jié)合固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，能夠?qū)ζ咸丫浦形毂交贰?氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺等5種化哇類殺菌劑同時進(jìn)行測定，該方法具 有準(zhǔn)確、快速、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，為葡萄酒的快速檢測提供了可靠的分析方法。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是包括W下步驟： (一)待測樣品的制備：稱取4. 7-5. 3g葡萄酒樣品，葡萄酒中加入超純水，混勻后得到待 檢液； 仁）待測樣品的凈化：將固定相萃取柱進(jìn)行預(yù)處理，將步驟(一）制備的待檢液上萃取 柱，經(jīng)水和甲醇/水溶液淋洗除去雜質(zhì)，再用洗脫溶劑洗脫固定相萃取柱上的戊苯化菌胺、 氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺得到洗脫液，將洗脫液濃縮富集后，用甲醇溶劑 稀釋并經(jīng)0. 22 y m微孔濾膜過濾后得到待測樣品溶液； (H)待測樣品的檢測：配制戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺溶 液階梯濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（1.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 ng/mL)，將步驟 (二）中的待測樣品溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀上分別進(jìn)樣，獲得W 標(biāo)準(zhǔn)溶液中戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺的濃度為橫坐標(biāo)，再W 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺的峰面積為 縱坐標(biāo)的工作曲線，還有獲得可W確定母離子的戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、口比 咪哇、巧化菌胺的一級質(zhì)譜圖，確定母離子后，采用子離子掃描獲得二級質(zhì)譜圖，然后從二 級質(zhì)譜圖中選取定量離子和定性離子，然后用工作曲線對定量離子進(jìn)行定量計算獲得待測 樣品溶液中戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺的濃度。
[0009] 進(jìn)一步設(shè)置是所述步驟(二)中的固定相萃取柱為Waters Oasis HLB S陽柱，并通 過甲醇、水對Waters Oasis HLB S陽柱進(jìn)行活化處理。
[0010] 進(jìn)一步設(shè)置是所述步驟(二）中的淋洗溶劑為水和體積比為2/3的甲醇水混合溶 液，洗脫溶劑為甲醇。
[0011] 進(jìn)一步設(shè)置是所述的步驟(H)中氣相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜的參數(shù)條件如下： 色譜柱；SGE 公司 BPX35 ;30 mXO. 25 mmXO. 25 y m 流速；1. Oml/min高純氮 儀器；Agilent 7890A-7000B 碰撞氣；高純氮；1. 5ml/min，巧滅流量；2. 25ml/min高純氮 升溫程序；50°C (Imin) -290°C (8min) 40°C /min 多模式進(jìn)樣口（匪I) ;5(TC (0. Imin) -300°C ;600°C /min 1分鐘打開分流閥，流量60ml/min 離子化；El源。
[0012] 本發(fā)明的的原理和優(yōu)點(diǎn)： 采用上述方案，首先，本發(fā)明通過加入超純水對葡萄酒樣品進(jìn)行稀釋， 其次，本發(fā)明還對由超純水稀釋得到的待檢液進(jìn)行凈化處理，該凈化處理包括純化和 富集的過程。第一步純化：先將待檢液通過固相萃取小柱，依次經(jīng)過經(jīng)水和甲醇/水溶液淋 洗、甲醇洗脫；第二步富集；將第一步中純化的待檢液氮?dú)鉂饪s近干，然后加入甲醇溶液溶 解、經(jīng)0. 22 y m微孔濾膜過濾，得到凈化的待檢液。該凈化后的待檢液則不會對檢測儀器造 成污染。本發(fā)明中固相萃取的SPE柱為Waters Oasis HLB SPE柱，由于5種化哇類殺菌劑 和其他雜質(zhì)的極性大小存在差異，在固相萃取柱上吸附產(chǎn)生保留差異，然后通過優(yōu)選的淋 洗條件和洗脫條件，達(dá)到凈化富集香料的目的。
[0013] 再次，本發(fā)明對于葡萄酒中戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌 胺等5種化哇類殺菌劑成分的定性定量檢測分析是通過氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（GC-MS/M巧 分析。先配置一組階梯形的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后將標(biāo)準(zhǔn)工作液和待檢液在氣相色譜-串聯(lián) 質(zhì)譜儀上分別進(jìn)樣。待檢液中出現(xiàn)的色譜峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液一致，允許偏差小于 ±2. 5 %，該色譜峰所對應(yīng)的質(zhì)譜定性離子的相對豐度與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)工作溶液的相對 豐度一致，而且相對豐度偏差不超過規(guī)定，則可確定該待檢液中含有化哇類殺菌劑。
[0014] 下面結(jié)合說明書附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步介紹。
【附