細(xì)胞的可視化和測量的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年8月21日提交的美國臨時專利申請第61/691，752號的優(yōu)先 權(quán)，該美國臨時申請的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合于此。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及包括細(xì)胞和組織樣本的生物樣本的成像。
【背景技術(shù)】
[0004] 染色劑和熒光劑廣泛用于可視化細(xì)胞和組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)。例如，在病理中，通常使用 蘇木精和伊紅染料制劑（H&)來可視化細(xì)胞和組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)。從以這種方式染色的細(xì)胞中 獲得的信息能夠用于識別細(xì)胞類型或組織結(jié)構(gòu)，或用于診斷疾病。為了同樣廣泛的目的，也 可以使用其他制劑，如巴氏染劑。這些染劑用于亮視野顯微鏡中，在該顯微鏡中，被染色的 樣本通過觀察通過樣本透射的光線予以觀看。通過染劑吸收或散射在樣本的圖像中產(chǎn)生顏 色或?qū)Ρ榷取?br>[0005] DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）是熒光復(fù)染劑，它結(jié)合細(xì)胞核和組織中的DNA 分子。它被廣泛用于熒光顯微鏡中，以確定樣本中的細(xì)胞核的位置或存在。在這項技術(shù)中， 樣本利用一個波長的光線（典型地是在350nm到370nm紫外范圍）激勵，并且樣本發(fā)出在 光譜的紫光區(qū)域中的光線。Hoechst33258染劑用于類似的目的，并且具有與DAPI類似的 激勵和發(fā)射特性。
[0006] 免疫熒光（IF)探針可用于對細(xì)胞和組織中的蛋白質(zhì)的存在、位置和量進(jìn)行成像。 這種探針的使用能夠針對各種研宄和臨床任務(wù)進(jìn)行高特定性測量。已經(jīng)研發(fā)了用于將多個 免疫熒光探針施加到單個樣本的技術(shù)。光學(xué)串?dāng)_以及諸如抗體相互作用和非特定性結(jié)合 的其他因素會限制能夠使用的探針的數(shù)量，并且會降低精度或者減少可用的蛋白質(zhì)表達(dá)范 圍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本文公開的系統(tǒng)和方法使用復(fù)染劑，該復(fù)染劑具有與標(biāo)志物類似的吸收和發(fā)射輪 廓（profile)，用于樣本內(nèi)的不同亞細(xì)胞區(qū)域。由于這些復(fù)染劑具有類似的發(fā)射輪廓，通常， 在樣本的熒光圖像中，它們不能被彼此視覺區(qū)分。光譜分離技術(shù)能夠用于將這些復(fù)染劑中 每一個的貢獻(xiàn)分離到多光譜圖像中。分離的圖像可以用于識別樣本內(nèi)的亞細(xì)胞區(qū)域，如樣 本內(nèi)的一個或多個細(xì)胞中的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。一個或多個IF探針可以施加到樣本上，以定 位和量化特定細(xì)胞實體，如在樣本不同區(qū)域之內(nèi)的蛋白質(zhì)。在一些實施方式中，如果是利用 H&E染劑制備并且在亮視野顯微鏡中觀察，則從模擬樣本將如何呈現(xiàn)的復(fù)染劑的分離圖像 中產(chǎn)生視圖。這提供了關(guān)于樣本的有價值的背景信息（contextinformation)，否則它將遺 失在熒光圖像中。
[0008] 通常，在第一方面中，本發(fā)明的特征系統(tǒng)包括：探測器，該探測器被構(gòu)造成獲得用 第一和第二染劑染色的樣本的多個圖像，其中第一和第二染劑具有類似的光譜吸收和發(fā)射 輪廓；以及電子處理器，該電子處理器被構(gòu)造成將所述多個圖像分解成分離的圖像組，其 中，被分離的圖像組包括對應(yīng)于第一染劑的第一分離圖像和對應(yīng)于第二染劑的第二分離圖 像，并且基于第一分離圖像識別樣本中的細(xì)胞核區(qū)域以及基于第二分離圖像識別樣本中的 細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。
[0009] 該系統(tǒng)的實施方式可包括如下特征中的一個或多個。
[0010] 所述電子處理器能夠被構(gòu)造成產(chǎn)生所述樣本的圖像，其中，樣本中的細(xì)胞核和細(xì) 胞質(zhì)區(qū)域以相同的方式著色，如同樣本用蘇木精和伊紅染色一樣。
[0011] 樣本可以包括一個或多個免疫熒光探針，并且被分離的圖像組可以包括各自與來 自僅僅一個免疫熒光探針的貢獻(xiàn)相對應(yīng)的分離圖像。所述電子處理器能夠被構(gòu)造成確定樣 本的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域中至少一些免疫熒光探針的量。所述樣本可以包括至少三個免疫 熒光探針（例如，至少五個免疫熒光探針）。
[0012] 所述多個圖像可以包括熒光圖像。所述第二染劑可以是CellMaskBlue。所述第 一染劑可以是DAPI。所述第一染劑可以是Hoechst33258。所述多個圖像可以限定圖像立 方體。多個圖像中的每一個可以對應(yīng)于針對熒光波長的不同對應(yīng)范圍的樣本的熒光圖像。
[0013] 所述系統(tǒng)可以包括多光譜成像系統(tǒng)，該多光譜成像系統(tǒng)耦接到所述探測器，其中， 所述多光譜成像系統(tǒng)被構(gòu)造成照亮所述樣本以獲得所述多個圖像。
[0014] 所述系統(tǒng)的實施方式也可以按需要以任何組合形式包括本文公開的任何其他特 征。
[0015] 在另一方面，本發(fā)明的特征方法包括向樣本施加至少兩種染劑，其中，所述至少兩 種染劑具有類似地的光譜吸收和發(fā)射輪廓；以及基于所述至少兩種染劑的光的吸收或發(fā)射 來識別樣本中的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。
[0016] 所述方法的實施方式可以包括如下特征中的任一個或多個。
[0017] 所述方法可以包括獲得樣本的多個圖像；將所述多個圖像分解成分離圖像組，其 中所述分離圖像組包括對應(yīng)于第一種染劑的第一分離圖像和對應(yīng)于第二種染劑的第二分 離圖像；以及基于第一分離圖像識別細(xì)胞核區(qū)域并基于第二分離圖像識別細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。
[0018] 所述方法可以包括產(chǎn)生樣本的圖像，其中，所述圖像中的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域以 與樣本利用蘇木精和伊紅染色的方式相同的方式來著色。
[0019] 所述樣本可以包括一個或多個免疫熒光探針，并且所述分離圖像組可以包括分離 圖像，每個分離圖像對應(yīng)于來自僅僅一個免疫熒光探針的貢獻(xiàn)。所述方法可以包括確定在 樣本中的細(xì)胞核區(qū)域和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域中至少一些免疫熒光探針的量。
[0020] 所述樣本可以包括至少三個免疫熒光探針（例如，至少五個免疫熒光探針）。所述 多個圖像可以包括熒光圖像。所述至少兩種染劑可以包括CellMaskBlue和DAPI。所述至 少兩種染劑可以包括CellMaskBlue和Hoechst33258。所述多個圖像可以限定圖像立方 體。所述多個圖像的每一個可以對應(yīng)于樣本的熒光圖像，用于熒光波長的不同對應(yīng)范圍。
[0021] 所述方法的實施方式還可以包括按需要任意組合的任何本文公開的其他特征或 步驟。
[0022] 在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的特征系統(tǒng)包括：探測器，所述探測器被構(gòu)造成獲得用第 一和第二染劑染色的樣本的多個圖像，其中，所述第一染劑包括DAPI或Hoeschst33258， 而第二染劑包括CellMaskBlue;以及電子處理器，所述電子處理器被構(gòu)造成將多個圖像分 解成分離的圖像組，其中，所述分離的圖像組包括對應(yīng)于第一染劑的第一分離圖像和對應(yīng) 于第二染劑的第二分離圖像；并且基于所述第一分離圖像識別樣本中的細(xì)胞核區(qū)域并基于 所述第二分離圖像識別樣本中的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。
[0023] 所述系統(tǒng)的實施方式可以包括如下特征中的任一個或多個。所述電子處理器可以 被構(gòu)造成產(chǎn)生樣本的圖像，其中，所述圖像中的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域以如同樣本用蘇木精 和伊紅染色一樣的方式被著色。
[0024] 所述樣本可以包括一個或多個免疫熒光探針，其中，所述分離圖像組包括分離圖 像，每個所述分離圖像對應(yīng)于來自僅僅一個免疫探針的貢獻(xiàn)。所述電子處理器可以被構(gòu)造 成確定所述樣本內(nèi)的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域中的至少一些免疫熒光探針的量。
[0025] 所述系統(tǒng)的實施方式還可以按需要以任何組合方式包括本文公開的任意其他特 征。
[0026] 在另一方面，本發(fā)明的特征方法包括將至少兩種染劑施加于所述樣本，其中，所述 第一染劑包括DAPI或Hoeschst33258,而第二染劑包括CellMaskBlue，并且基于至少兩 種染劑的光線的吸收或發(fā)射來識別樣本中的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。
[0027] 所述方法的實施方式可以包括如下特征中的任一個或多個。
[0028] 所述方法可以包括獲得樣本的多個圖像，將所述多個圖像分解成分離圖像組，其 中，所述分離圖像組包括對應(yīng)于所述染劑中的第一種的第一分離圖像和對應(yīng)于所述染劑中 的第二種的第二分離圖像；以及基于所述第一分離圖像識別細(xì)胞核區(qū)域并且基于所述第二 分離圖像識別細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。
[0029] 所述方法可以包括產(chǎn)生樣本的圖像，其中所述樣本中的細(xì)胞核區(qū)域和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域 以如同樣本用蘇木精和伊紅染色那樣相同的方式被著色。
[0030] 所述樣本可以包括一個或多個免疫熒光探針，并且所述分離圖像組可以包括分離 圖像，每個所述分離圖像對應(yīng)于來自僅僅一個免疫熒光探針的貢獻(xiàn)。所述方法可以包括確 定所述樣本內(nèi)的細(xì)胞核區(qū)域和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域中的至少一些免疫熒光探針的量。
[0031] 所述方法的實施方式也可以按需要以任何組合方式包括本文中公開的任何其他 特征或步驟。
[0032] 除非另有限定，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。雖然與本文描述的那些類似的或等價的方法和材料可 以在本文的主題的實踐和測試中使用，但是在下面描述適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧稀Ｔ诖颂岬降乃?有出版物、專利申請、專利和其他參考文件通過引用整體結(jié)合于此。在沖突的情況下，本說 明書，包括定義在內(nèi)，將起主導(dǎo)作用。另外，材料、方法和示例僅僅是說明性的，而非意在限 制。
[0033] 在下面的附圖和描述中陳述了一個或多個實施方式的細(xì)節(jié)。其他特征和優(yōu)點將從 該描述、附圖和權(quán)利要求中顯而易見。
【附圖說明】
[0034] 圖1是示出針對CellMaskBlue和DAPI染劑的發(fā)射光譜的曲線，該發(fā)射光譜是從 用這些染劑制備的樣本中測量的；
[0035] 圖2是用CellMask Blue和DAPI制備的樣本的圖像；
[0036] 圖3是圖2的樣本的圖像，示出細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)組分；暗灰色區(qū)域?qū)?yīng)于細(xì)胞質(zhì)， 而淡灰色區(qū)域?qū)?yīng)于細(xì)胞核組分；
[0037] 圖4是圖2的樣本的圖像，該圖像被遮擋（shade)以顯示如果樣本用H&E染色，它 是如何顯現(xiàn)的；
[0038] 圖5是圖2的樣本的圖像，其中每個細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核組分被分段并且渲染 為圖像上的覆蓋層；
[0039] 圖6是用于獲取樣本的多個光譜解析圖的系統(tǒng)的示意圖。
[0040] 各個