附圖中相同的附圖標記表示相同的元件。
【具體實施方式】
[0041] 識別阻止和細胞內(nèi)的不同亞細胞區(qū)域的傳統(tǒng)方法（尤其是，識別與細胞核對應的 區(qū)域以及與細胞質(zhì)對應的區(qū)域的傳統(tǒng)方法）涉及到向樣本施加多種復染劑，其中，所施加 的復染劑中的一種被用于識別細胞核區(qū)域，而其他的用于識別細胞質(zhì)。這些染劑通常被選 擇成使得它們的吸收或發(fā)射輪廓在光譜上良好地分離。通過改變用于照亮樣本的光線的波 長，每種染劑能夠各自選擇性相互作用（interrogated)，并且對應于細胞核和細胞質(zhì)的樣 本的區(qū)域可以彼此區(qū)分開。在樣本的圖像中，每個像素可以被指派給細胞核區(qū)域或細胞質(zhì) 區(qū)域。
[0042] 可替代的，可以使用多頻帶激勵濾波器，并且兩種復染劑可以被同時激勵；假設所 述復染劑具有良好分離的發(fā)射輪廓，其典型地對應于不同的顏色，基于所導致的發(fā)射中的 顏色差異，彩色攝像機或人類觀察者能夠?qū)⒓毎藚^(qū)域從細胞質(zhì)區(qū)域區(qū)分開。
[0043] 但是，使用具有顯著不同吸收輪廓的兩種復染劑會使得電磁波譜的相當大量的可 視部分不可用于其他成像目的。具體地說，可以用于識別蛋白質(zhì)和其他實體的特定類型的IF探針的數(shù)量和類型被減少，這是因為復染劑所使用的光譜的部分不可以被IF探針使用。 [0044] 與用于識別細胞核和細胞質(zhì)區(qū)域的傳統(tǒng)染色協(xié)議相反，本文公開的系統(tǒng)和方法使 用具有類似光譜吸收輪廓的復染劑來識別細胞核和細胞質(zhì)區(qū)域。以這種方式，光譜的大部 分可視部分仍可與IF探針一起使用。
[0045] 相對于傳統(tǒng)染色協(xié)議，更大數(shù)量的IF探針能夠與單個樣本一起使用，提供了多種 優(yōu)點，其中，可以從樣本獲取更多信息。另外，通過從單個樣本獲取信息，可以消除測量結(jié)果 中的變動，否則，該測量結(jié)果的變動會由于樣本與樣本的差異而產(chǎn)生。例如，可以獲知單個 細胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)的相對值和比率，這對于細胞而言是高度信息性的，給出細胞行為的 信號。
[0046] 此外，部分由于它們類似的光譜吸收輪廓，在本發(fā)明中用于識別樣本內(nèi)的細胞核 區(qū)域和細胞質(zhì)區(qū)域的復染劑也具有類似的光譜發(fā)射輪廓。結(jié)果，在兩種復染劑已經(jīng)施加其 上的樣本的圖像中，通常裸眼不可識別復染劑。但是，在下面進一步詳細描述的光譜分離方 法能夠用于將這些復染劑中每一種對光譜圖像的貢獻分離開，使得能夠識別不同的樣本區(qū) 域。滿足這些標準的一對復染劑的一個示例是DAPI(用于識別細胞核區(qū)域）和CellMask Blue(用于識別細胞質(zhì)）。滿足這些標準的一對復染劑的另一個示例是Hoechst33258 (用 于識別細胞核區(qū)域）和CellMaskBlue。
[0047] 通過適當選擇用于識別樣本區(qū)域（例如，細胞核區(qū)域和細胞質(zhì)區(qū)域）的復染劑，復 染劑和IF探針之間的光譜串擾可以被降低或消除。這提高了量化信息的可靠性，該量化信 息提取自IF探針的熒光測量結(jié)果。例如，在一些實施方式中，樣本用DAPI染色，以識別細 胞核區(qū)域，并用CellMaskBlue染色以識別細胞質(zhì)。在電磁波譜的可視部分內(nèi)，這些復染劑 都不會強烈吸收光線。這意味著來自很多IF探針的熒光不會被復染劑明顯吸收。并且，復 染劑不會被用于激勵普通IF探針的可見光激勵。結(jié)果，更多的這種IF探針可以施加到相 同樣本以瞄準（target)特定細胞結(jié)構(gòu)，而不會受到復染劑干涉或與復染劑光譜串擾。這增 加了能夠被測量的蛋白質(zhì)或其他感興趣化合物的數(shù)量。當具有適當光譜屬性的其他復染劑 被用于識別細胞核和細胞質(zhì)區(qū)域時，也可以實現(xiàn)類似的優(yōu)點。
[0048] 當用于識別樣本區(qū)域的染劑不是本身基于抗體的時，在實施方式中實現(xiàn)了另外的 優(yōu)點。例如，CellMaskBlue是一種非基于抗體的樣本復染劑，并且它不與IF探針標記中 使用的其他抗體干涉。DAPI和Hoechst染劑也是如此。由此，從抗體相互作用以及光學干 涉的觀點，它們不限制能夠施加到樣本上的IF探針的數(shù)量，降低從IF探針獲得的量化結(jié)果 的精度或者減小能夠被探測的有用的蛋白質(zhì)表達范圍。
[0049] 本發(fā)明的再另一個優(yōu)點在于：由于細胞質(zhì)信息是在很小的額外復雜度情況下得 出，并且不會減少能夠使用的IF探針的數(shù)量，細胞質(zhì)信息能夠在實驗中獲得，否則在試驗 中細胞質(zhì)信息根本不可得，或者將以有價值的IF信息為代價來獲得?？傊?，在很多情況下， 該效果是使得獲得細胞質(zhì)信息可行，否則該信息將是缺失的。
[0050] 本文中公開的系統(tǒng)和方法也實現(xiàn)基于獲得的測量數(shù)據(jù)對圖像進行合成和顯示。例 如，在一些實施方式中，提供了所述系統(tǒng)和方法，該系統(tǒng)和方法用于利用熒光劑（例如，IF 探針）處理生物樣本，在多光譜成像系統(tǒng)中對樣本成像，以及產(chǎn)生數(shù)字合成圖像，所述數(shù)字 合成圖像在外觀上與在樣本用H&E制備并且在亮視野顯微鏡下觀察的情況下所具有的外 觀在視覺上類似。這種視圖被稱為數(shù)字H&E視圖。
[0051] 通過獲得關于樣本之內(nèi)的各區(qū)域（例如細胞核區(qū)域和細胞質(zhì)區(qū)域）的信息以及 關于樣本內(nèi)的各種IF探針的位置的信息，來自每個IF探針的棉衣熒光信號能夠被量化并 且與樣本內(nèi)的各區(qū)域相關聯(lián)。例如，與樣本的細胞核區(qū)域以及與細胞質(zhì)區(qū)域相關聯(lián)的特定 免疫熒光信號的量可以被確定。此外，對于在一個或多個細胞內(nèi)的不同類型區(qū)域（例如，細 胞核和細胞質(zhì)）中的每一個而言，可以量化多個免疫熒光信號。數(shù)字圖像可以顯示細胞核 區(qū)域、細胞質(zhì)區(qū)域或二者的位置。這種圖像也可以顯示這些區(qū)域內(nèi)一個或多個IF探針的位 置。
[0052] 如在此使用的，"染劑"是指為被染色的所關注組分提供光譜簽名的化合物或結(jié)構(gòu) (例如，染料）。例如，光譜簽名對應于從染劑吸收或發(fā)射的光譜分布。術語"復染劑"具體 是指不提供高程度分子特異性，但代之通常在施加到樣本上時結(jié)合特定生理結(jié)構(gòu)的染劑。 例如，DAPI是公知的熒光染料，其能夠施加到生物樣本上，以提供空間情景和地標。具體地 說，DAPI優(yōu)先結(jié)合到細胞核，并由此在細胞的細胞核與非細胞核組分之間提供對比。但是 它不具有與IF探針相關聯(lián)的高程度的分子特異性?？梢耘c本文公開的方法和系統(tǒng)一起使 用的復染劑的其他示例包括CellMaskBlue，Hoechst33258和Hoechst33342。
[0053] IF探針可以結(jié)合熒光部分，如熒光素、若單明、熒石的Alexa系列（可自 InVitrogen,Carlsbad,CA購得）、四乙基若丹明異硫氰酸鹽（TRITC)、焚石的Cy系列（可自 GEHealthcareBiosciences,Pittsburgh,PA購得）、或其他焚石，這取決于諸如成本或個 人喜好、成像設備的能力、可用的材料之類的因素和可能產(chǎn)生的其他因素，只要激勵或發(fā)射 特性與復染劑的激勵或發(fā)射特性區(qū)分開即可。可替代的是，IF探針可以使用量子點，而非 熒光分子來產(chǎn)生發(fā)射光。
[0054] 多光譜成像系統(tǒng)
[0055] 在已經(jīng)利用具有類似吸收和發(fā)射輪廓的復染劑（單獨用于識別不同的樣本區(qū)域 (例如，細胞核區(qū)域和細胞質(zhì)區(qū)域））染色樣本，并且可選的，一個或多個IF探針已經(jīng)施加到 樣本之后，樣本在多光譜成像系統(tǒng)中成像以獲得樣本的一個或多個圖像。圖6是示出用于 獲取樣本的多光譜解析圖像的系統(tǒng)1〇〇的示意圖。光源102將光線122提供到光調(diào)節(jié)光學 器件104。光線122可以是非相干光，如從例如燈絲光源產(chǎn)生的光線，或者光線122可以是 相干光，如激光器產(chǎn)生的光線。光線122可以或是連續(xù)波（CW)的或時間門控的（即，脈沖 的）光線。此外，光線122可以在電磁波譜的選擇部分內(nèi)提供。例如，光線122可以具有落 入光譜的紫外線、可見光、紅外線或其他區(qū)域內(nèi)的中間波長和/或波長分布。
[0056] 光調(diào)節(jié)光學器件104可以被構(gòu)造成以多種方式轉(zhuǎn)變光線122。例如，光調(diào)節(jié)光學器 件104能夠在光譜上過濾光線122,以提供在光譜的選定波長區(qū)域內(nèi)的輸出光?？商娲鼗?另外地，光調(diào)節(jié)光學器件可以調(diào)節(jié)光線122的空間分布和光線122的時間屬性。入射光線 122是通過光調(diào)節(jié)光學器件104的元件的作用而由光線122產(chǎn)生。
[0057] 入射光線122被引導以入射到照明臺106上安裝的樣本108上。臺106提供了固 定樣本108的裝置，如安裝夾或其他緊固裝置?？商娲?，臺106可以包括可移動的軌道或 帶，其上固定多個樣本108。驅(qū)動器機構(gòu)可以被構(gòu)造成移動軌道，以便將多個樣本一次一個 地依次平移通過臺106上的照明區(qū)域，在該區(qū)域，入射光線122投射到其上。樣本108可以 進一步保持在載體或匣中，以利于操縱。臺106可以進一步包括用于相對于照明臺106的 固定位置平移樣本108的平移軸和機構(gòu)。平移機構(gòu)可以手動操作（例如絲杠）或者可以通 過電致動（例如，機動驅(qū)動器、壓電致動器等）而自動移動。
[0058] 響應于入射光線124,發(fā)射光線126從樣本108中浮現(xiàn)。典型地，入射光線124被 樣本108吸收，并且發(fā)射光線126對應于響應入射光線124而來自樣本108的熒光發(fā)射。
[0059] 在一些實施方式中，樣本108是來自人或動物的病理樣本。它可以是組織切片或 細針吸引物。在特定實施方式中，樣本是通過擦拭或刮拭肺、子宮頸、胃腸道、或其他器官而 獲得的細胞的集合。在一些實施方式中，樣本可以包括從血液、咳痰或其他生物流體獲得的 細胞。尤其是，在一些實施方式中，樣本可以包括血液樣本，其被檢驗以用于循環(huán)腫瘤細胞 或其他罕見細胞。在一些實施方式中，樣本108可以包括單個細菌或其他微生物，或者來自 細胞培養(yǎng)的細胞。樣本108中的細胞或組織可以是活的、固定的或者更寬泛地說按需要處 于任何狀態(tài)。
[0060] 光收集光學器件110定位成接收來自樣本108的發(fā)射光線126。光收集光學器件 110可以被構(gòu)造成例如在光線126是發(fā)散的時準直該發(fā)射光線126。光收集光學器件110 也可以被構(gòu)造成光譜上過濾發(fā)射光線126。過濾操作會是有用的，例如，以便將通過上面討 論的機構(gòu)中的一個產(chǎn)生的發(fā)射光線126的一部分與通過其他過程產(chǎn)生的光線隔離開。進一 步地，光收集光學器件110可以被構(gòu)造成改進發(fā)射光線126的空間和/或時間屬性，以用于 實施方式中的特定目的。光收集光學器件100將發(fā)射光線126轉(zhuǎn)變成入射到探測器112上 的輸出光線128。
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