一種免疫層析試紙條及其制作方法與檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫層析檢測(cè)技術(shù)，特別涉及增加了一條判定線的免疫層析試紙條及其制作方法與檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫層析技術(shù)是將免疫標(biāo)記技術(shù)與層析技術(shù)結(jié)合起來(lái)的一種新型檢測(cè)技術(shù)，可以利用標(biāo)記物的顯色特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的定性、半定量、定量分析。它是以微孔濾膜為固相載體，以待測(cè)液為流動(dòng)相，利用微孔濾膜的毛細(xì)作用及虹吸作用引導(dǎo)待測(cè)液體向前流動(dòng)，同時(shí)待測(cè)液中的相關(guān)成分和固定在濾膜上的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物后，滯留在檢測(cè)線上，通過(guò)對(duì)標(biāo)記物顏色的深淺或熒光的光密度分析，從而得到直觀的檢測(cè)結(jié)果。
[0003]目前，大多數(shù)商業(yè)化的定點(diǎn)即時(shí)檢測(cè)手段主要是以免疫層析試驗(yàn)(ICA)居多，該試驗(yàn)也被稱之為橫向測(cè)流檢測(cè)(LFT)。免疫層析試驗(yàn)操作非常簡(jiǎn)單，結(jié)合了免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的原理與薄層色譜技術(shù)，加樣后即可在規(guī)定時(shí)間內(nèi)如10分鐘或20分鐘左右得到檢測(cè)結(jié)果。
[0004]免疫層析試紙條主要包含五個(gè)部分:加樣區(qū)(樣品墊)、標(biāo)記區(qū)(結(jié)合墊)、顯示區(qū)(硝酸纖維素膜)、吸水區(qū)(吸水墊)以及背襯板。
[0005]樣品墊可以是纖維素、玻璃纖維、人造纖維等等濾過(guò)性介質(zhì)，主要目的是過(guò)濾樣本中的顆粒、調(diào)節(jié)樣本的PH以及結(jié)合樣本中干擾隨后層析反應(yīng)的成分；結(jié)合墊可以是玻璃纖維、聚酯纖維或者人造纖維，主要目的是裝載標(biāo)記物如納米金標(biāo)記單抗、二抗等并在層析檢測(cè)中穩(wěn)定地釋放這些標(biāo)記物；硝酸纖維素膜的主要作用是固化抗原或者抗體等并提供層析檢測(cè)反應(yīng)的場(chǎng)所，在免疫層析實(shí)驗(yàn)中主要用接觸式或非接觸式點(diǎn)樣儀在膜上線狀固化抗原或抗體等形成檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)；吸水墊一般為高密度的纖維素，是層析反應(yīng)的動(dòng)力源，控制著層析反應(yīng)中待檢樣品持續(xù)流動(dòng)的方向；背襯則為聚苯乙烯或者其他塑料材料，用于為免疫層析試紙條的層疊結(jié)構(gòu)提供剛性支持。
[0006]當(dāng)樣品墊加入待檢樣品如血清、尿液等，如果待檢樣品中有靶分子，則與結(jié)合墊中的標(biāo)記物反應(yīng)形成復(fù)合物，在毛細(xì)作用下通過(guò)硝酸纖維素膜向吸收墊方向流動(dòng)，并被硝酸纖維素膜上固化的相應(yīng)的抗原或抗體等配體分子捕獲(捕獲位置分別在檢測(cè)線和質(zhì)控線上)而被肉眼或者與標(biāo)記物對(duì)應(yīng)的設(shè)備檢測(cè)到。
[0007]根據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)形式的不同可以將免疫層析試紙條分為兩種類型:三明治夾心檢測(cè)和競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)。前者利用檢測(cè)線上固化的捕獲抗體或者抗原對(duì)分析物進(jìn)行捕獲固定，同時(shí)標(biāo)記抗體或者抗原對(duì)分析物進(jìn)行標(biāo)記，由此形成夾心結(jié)構(gòu)復(fù)合物，主要用于檢測(cè)具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的較大分析物，人們熟知的早早孕自檢試紙條就是利用這種技術(shù)。
[0008]而競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)是待檢分析物與檢測(cè)線上固化的同等分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合墊上的抗體或者其他配體標(biāo)記物，結(jié)果的判定與三明治夾心檢測(cè)法正好相反，主要用于檢測(cè)只有單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的小分子分析物。
[0009]免疫層析試紙條結(jié)果的判讀主要有以下兩種:一是直接肉眼觀察檢測(cè)線是否顯色來(lái)判斷待測(cè)物的有無(wú)；二是用相關(guān)儀器讀取試紙條檢測(cè)線上的信號(hào)強(qiáng)度，給出一個(gè)定量或半定量的待測(cè)物含量，其信號(hào)強(qiáng)度和待測(cè)物含量呈正相關(guān)關(guān)系。
[0010]而免疫層析檢測(cè)法這種檢測(cè)模式由于其簡(jiǎn)便、有效、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，在目前的定點(diǎn)即時(shí)檢測(cè)中的市場(chǎng)需求依然十分旺盛，基于此檢測(cè)模式的各種標(biāo)記分析方式還在不斷被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用到如蛋白檢測(cè)、核酸檢測(cè)、病毒學(xué)、細(xì)菌學(xué)、抗生素等領(lǐng)域中。
[0011]1、現(xiàn)有判定方法容易導(dǎo)致高濃度待測(cè)物檢驗(yàn)假陰性現(xiàn)象
[0012]高濃度的待測(cè)物中，會(huì)有大量的未與標(biāo)記區(qū)抗體結(jié)合的游離抗原剩余，該游離抗原層析的速度會(huì)快于待測(cè)物中與標(biāo)記區(qū)抗體結(jié)合形成的免疫復(fù)合物的層析速度，從而搶先與T線的抗體相結(jié)合，占用結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致免疫復(fù)合物無(wú)位點(diǎn)空間和T線結(jié)合，從而表現(xiàn)出假陰性。
[0013]由于免疫層析檢測(cè)有其操作簡(jiǎn)單、無(wú)需專業(yè)人員操作等優(yōu)點(diǎn)，就要求其所用的免疫層析試紙條必須結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、體積短小、便于攜帶及操作。
[0014]理論上講，當(dāng)在加樣區(qū)滴加待測(cè)物后，經(jīng)過(guò)標(biāo)記區(qū)時(shí)，待測(cè)物應(yīng)該與標(biāo)記的抗體混合接觸，特異性結(jié)合后形成免疫復(fù)合物，形成的免疫復(fù)合物再繼續(xù)向前流經(jīng)顯示區(qū)發(fā)生反應(yīng)并顯示檢測(cè)結(jié)果。
[0015]而因?yàn)槠潴w積短小，長(zhǎng)度較短，當(dāng)在加樣區(qū)滴加待測(cè)物后，在毛細(xì)作用下，待測(cè)液體被快速虹吸經(jīng)過(guò)標(biāo)記區(qū)、顯示區(qū)。因?yàn)榇郎y(cè)物與標(biāo)記的抗原或抗體接觸的時(shí)間較短，必然會(huì)存在抗原抗體反應(yīng)不充分的現(xiàn)象，那么就會(huì)有未被捕獲的待測(cè)物和已經(jīng)形成的免疫復(fù)合物共同虹吸至顯色區(qū)，而免疫復(fù)合物因?yàn)楸扔坞x待測(cè)物空間位阻大，其流動(dòng)速度要落后于游離的待測(cè)物，所以就會(huì)有未被捕獲的待測(cè)物先于免疫復(fù)合物到達(dá)檢測(cè)線上，與固定在顯示區(qū)的抗原或抗體反應(yīng)，占據(jù)理論上本該結(jié)合免疫復(fù)合物的位點(diǎn)，導(dǎo)致檢測(cè)線上滯留的免疫復(fù)合物減少，檢測(cè)線上的信號(hào)強(qiáng)度就會(huì)比理論上的弱，所以容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。
[0016]2、目前試紙條結(jié)果的判讀方法中，只要質(zhì)控線顯色，無(wú)論是肉眼觀察還是儀器讀取結(jié)果，大都只是觀察檢測(cè)線上的信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)果判定依據(jù)單一，容易產(chǎn)生誤差。
[0017]由于傳統(tǒng)的基于納米金的免疫層析試紙條是肉眼直接觀察，靈敏度有限，其他方法，例如酶法、銀染增強(qiáng)法、化學(xué)發(fā)光法或是熒光法，有的需要熒光激發(fā)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，配合檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢查，操作復(fù)雜且成本較高。
[0018]本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于提供一種免疫層析試紙條及其制作方法與檢測(cè)方法，既能夠操作簡(jiǎn)單且成本較低，又能夠有效降低免疫層析檢測(cè)假陰性現(xiàn)象的發(fā)生率，具有更高的靈敏度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種免疫層析試紙條，硝酸纖維素膜除了檢測(cè)線與質(zhì)控線，還包括雙抗線，能夠有效降低免疫層析檢測(cè)假陰性現(xiàn)象的發(fā)生率，具有更高的靈敏度。
[0020]本發(fā)明還提供一種免疫層析試紙條的制作方法。
[0021]本發(fā)明還提供一種雙抗線免疫層析檢測(cè)方法，與現(xiàn)有的免疫層析檢測(cè)中單獨(dú)質(zhì)控線輔助判定法相比，能夠有效降低免疫層析檢測(cè)假陰性現(xiàn)象的發(fā)生率，靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、檢測(cè)快速且操作簡(jiǎn)便。
[0022]本發(fā)明提供一種免疫層析試紙條，包括:樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊以及背襯板，硝酸纖維素膜包括檢測(cè)線與質(zhì)控線，硝酸纖維素膜還包括雙抗線。
[0023]本發(fā)明的免疫層析試紙條，包含新的判定線，即雙抗線，該判定線根據(jù)其組成成分命名的，因其含有抗原和抗體，故名為雙抗。其中抗體的作用是固定抗原，不參與檢測(cè)過(guò)程中的反應(yīng)；抗原的作用是在檢測(cè)過(guò)程中捕獲標(biāo)記抗體。
[0024]進(jìn)一步地，雙抗線設(shè)置于檢測(cè)線與質(zhì)控線之間。
[0025]進(jìn)一步地，雙抗線包括抗原，抗原為與待測(cè)物相同的純抗原溶液。
[0026]進(jìn)一步地，雙抗線還包括與抗原對(duì)應(yīng)的抗體，抗原被抗體結(jié)合并固定在硝酸纖維素膜上。
[0027]進(jìn)一步地，標(biāo)記抗體為膠體金、磁性納米粒子、量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換納米材料中的一種。
[0028]本發(fā)明還提供一種免疫層析試紙條的制作方法，包括以下步驟:
[0029](I)制作標(biāo)記抗體；
[0030](2)將標(biāo)記抗體固定于結(jié)合墊；
[0031](3)在硝酸纖維素膜上制作檢測(cè)線、雙抗線及質(zhì)控線；
[0032](4)制作樣品墊；
[0033](5)在背襯板上依次粘貼樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，各相鄰墊之間相互重疊約1.5mm。
[0034]硝酸纖維素膜最靠近背襯板，結(jié)合墊和吸水墊分別搭接在硝酸纖維素膜的兩端，樣品墊搭接在結(jié)合墊的另一端。
[0035]進(jìn)一步地，步驟(3)中在硝酸纖維素膜上制作雙抗線包括以下步驟:
[0036](31)采用多克隆抗體溶液在硝酸纖維素膜的雙抗線區(qū)域噴一條待測(cè)物的抗體線，抗體線的寬度、長(zhǎng)度與檢測(cè)線的寬度、長(zhǎng)度相同；
[0037](32)用聚乙二醇(PEG)和N-羥基丁二酰亞胺(NHs)處理過(guò)的抗原溶液噴在雙抗線區(qū)域；
[0038](33)雙抗線區(qū)域發(fā)生抗原抗體的免疫反應(yīng)后，抗體的Fab端(Fab端為一個(gè)抗體分子上的兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn))被抗原結(jié)合封閉，使得抗原分子通過(guò)抗原-抗體結(jié)合作用力而間接固定在硝酸纖維素膜上。
[0039]本發(fā)明還提供一種使用免疫層析試紙條的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0040](I)將待測(cè)樣品加入免疫層析試紙條的樣品墊；
[0041](2)采用檢測(cè)儀檢測(cè)免疫層析試紙條檢測(cè)線上的信號(hào)強(qiáng)度；
[0042](3)根據(jù)免疫層析試紙條的信號(hào)強(qiáng)度與濃度對(duì)應(yīng)的二次函數(shù)，以及步驟(2)中讀取的信號(hào)強(qiáng)度，得到信號(hào)強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的兩個(gè)濃度值，其中一個(gè)為位于二次函數(shù)曲線最高點(diǎn)左側(cè)的第一濃度值，另一個(gè)為位于最高點(diǎn)右側(cè)的第二濃度值；
[0043](4)比較免疫層析試紙條的雙抗線和質(zhì)控線的信號(hào)強(qiáng)度，如果雙抗線上的信號(hào)強(qiáng)度大于質(zhì)控線上的信號(hào)強(qiáng)度，則待測(cè)樣品中待測(cè)物的濃度為第一濃度值；如果雙抗線上的信號(hào)強(qiáng)度小于質(zhì)控線上的信號(hào)強(qiáng)度，則待測(cè)樣