另一個(gè)為位于最高點(diǎn)右側(cè)的第二濃度值；
[0097](4)比較免疫層析試紙條的雙抗線和質(zhì)控線的信號(hào)強(qiáng)度，如果雙抗線上的信號(hào)強(qiáng)度大于質(zhì)控線上的信號(hào)強(qiáng)度，則待測(cè)樣品中待測(cè)物的濃度為第一濃度值；如果雙抗線上的信號(hào)強(qiáng)度小于質(zhì)控線上的信號(hào)強(qiáng)度，則待測(cè)樣品中待測(cè)物的濃度為第二濃度值。
[0098]進(jìn)一步地，步驟(3)中免疫層析試紙條的信號(hào)強(qiáng)度與濃度對(duì)應(yīng)的二次函數(shù)獲得的方法包括以下步驟:
[0099](31)配制一組濃度梯度的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)液，滴加到免疫層析試紙條的樣品墊上；
[0100](32)5?20分鐘后用檢測(cè)儀檢測(cè)硝酸纖維素膜上檢測(cè)線、雙抗線、質(zhì)控線的信號(hào)強(qiáng)度；
[0101](33)分別將步驟(32)中得到的信號(hào)強(qiáng)度及其所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物濃度進(jìn)行Log函數(shù)變換；
[0102](34)以變換后的待測(cè)物濃度值作X軸，以變換后的信號(hào)強(qiáng)度值作Y軸，分別作出檢測(cè)線、雙抗線及質(zhì)控線的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0103](35)得出檢測(cè)線上信號(hào)強(qiáng)度與濃度對(duì)應(yīng)的二次函數(shù)公式。
[0104]本發(fā)明原理是:當(dāng)待測(cè)液(內(nèi)含靶分子抗原)滴在加樣區(qū)，在毛細(xì)作用下，液體從檢測(cè)線端向吸水紙端不斷滲移，在此滲移過(guò)程中檢測(cè)線上可能截留的物質(zhì)包括未與標(biāo)記區(qū)標(biāo)記抗體反應(yīng)的游離抗原和在標(biāo)記區(qū)發(fā)生抗原-抗體免疫反應(yīng)的復(fù)合物。雙抗線上可能截留的物質(zhì)是標(biāo)記區(qū)內(nèi)未與抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的標(biāo)記抗體。質(zhì)控線上可能截留的物質(zhì)包括標(biāo)記區(qū)未與抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的標(biāo)記抗體和無(wú)法停留在檢測(cè)線上的抗原-抗體免疫復(fù)合物。隨著待測(cè)液中抗原濃度由零逐漸升高時(shí)，抗原、抗體在標(biāo)記區(qū)反應(yīng)相對(duì)完全，被捕獲在檢測(cè)線上的免疫復(fù)合物逐漸增多，信號(hào)數(shù)值增大。被捕獲在雙抗線和質(zhì)控線上未與抗原反應(yīng)的標(biāo)記抗體均逐漸減少，信號(hào)數(shù)值降低。
[0105]而當(dāng)待測(cè)液中抗原濃度超過(guò)一定濃度時(shí)，在標(biāo)記區(qū)抗原、抗體反應(yīng)不完全，會(huì)有大量的未反應(yīng)游離抗原殘留，繼續(xù)參與滲移現(xiàn)象。由于單純的抗原層析速度大于抗原抗體免疫復(fù)合物，優(yōu)先被捕獲在檢測(cè)線上，占用了檢測(cè)線上抗體的結(jié)合位點(diǎn)，從而導(dǎo)致檢測(cè)線上捕獲的免疫復(fù)合物逐漸減少，數(shù)值逐漸減小，而逐漸增多的免疫復(fù)合物均被捕獲在質(zhì)控線上，出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。該情況下，被捕獲在雙抗線上未與抗原反應(yīng)的標(biāo)記抗體仍然是逐漸減少，數(shù)值減弱。
[0106]根據(jù)此現(xiàn)象，用檢測(cè)儀檢測(cè)顯示區(qū)檢測(cè)線、雙抗線、質(zhì)控線的信號(hào)強(qiáng)度，并將信號(hào)強(qiáng)度及其所對(duì)應(yīng)的抗原濃度作Log函數(shù)變換，以變換后的濃度值作X軸，以變換后的信號(hào)強(qiáng)度值作Y軸，分別作出檢測(cè)線、雙抗線及質(zhì)控線的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖2所示，得出檢測(cè)線上信號(hào)強(qiáng)度與濃度對(duì)應(yīng)的二次函數(shù)公式。
[0107]根據(jù)該公式可以準(zhǔn)確的計(jì)算出待測(cè)液中抗原的濃度范圍及準(zhǔn)確數(shù)值。圖2中，I為質(zhì)控線，2為雙抗線，3為檢測(cè)線，橫坐標(biāo)為待測(cè)液中抗原濃度，縱坐標(biāo)為信號(hào)數(shù)值。
[0108]如圖2所示，質(zhì)控線、雙抗線的交點(diǎn)和檢測(cè)線縱坐標(biāo)的最大值幾乎在同一垂直線。選取相對(duì)對(duì)稱(chēng)的檢測(cè)線曲線作為計(jì)算曲線，雙抗線和質(zhì)控線曲線作為輔助判別曲線。
[0109]從檢測(cè)線的趨勢(shì)線圖我們可以觀察到，在曲線最高點(diǎn)的左右兩側(cè)均出現(xiàn)同一縱坐標(biāo)數(shù)值對(duì)應(yīng)不同大小兩個(gè)橫坐標(biāo)數(shù)值，并且這兩個(gè)橫坐標(biāo)數(shù)值出現(xiàn)在檢測(cè)線曲線縱坐標(biāo)最大值所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)數(shù)值兩側(cè)，數(shù)值一大一小。此時(shí)，需要借助雙抗線和質(zhì)控線來(lái)進(jìn)一步定量判定待測(cè)液中抗原濃度(橫坐標(biāo)單位)的范圍。
[0110]選取方法是比較同一橫坐標(biāo)刻度所對(duì)應(yīng)的雙抗線和質(zhì)控線的縱坐標(biāo)數(shù)值大小，如果雙抗線上的縱坐標(biāo)數(shù)值大于質(zhì)控線上的縱坐標(biāo)數(shù)值，則判定為計(jì)算出的橫坐標(biāo)上較小的低濃度數(shù)值。反之，如果雙抗線上的縱坐標(biāo)數(shù)值小于質(zhì)控線上的縱坐標(biāo)數(shù)值，則判定為計(jì)算出的橫坐標(biāo)上較大的高濃度數(shù)值。按照此函數(shù)曲線計(jì)算，貝lJ無(wú)論待測(cè)液中抗原濃度過(guò)低或過(guò)高都能有效的避免傳統(tǒng)試紙條產(chǎn)生的誤差及準(zhǔn)確判定高濃度抗原待測(cè)物引起的假陰性現(xiàn)象。
[0111]本發(fā)明提供的免疫層析試紙條及其制作方法與檢測(cè)方法，不僅保留了傳統(tǒng)免疫層析檢測(cè)試紙條操作簡(jiǎn)便、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、低成本的優(yōu)點(diǎn)，還有效避免了傳統(tǒng)試紙條在待測(cè)物高濃度時(shí)產(chǎn)生的假陰性現(xiàn)象，有效提高免疫層析法檢測(cè)的準(zhǔn)確性，擴(kuò)大了線性檢測(cè)范圍；不局限于檢測(cè)線的信號(hào)強(qiáng)度，而是綜合利用顯示區(qū)上三條線的信號(hào)強(qiáng)度以及三者信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系，因而能夠準(zhǔn)確地判斷待測(cè)物的濃度，大大提高了免疫層析檢測(cè)的靈敏度和特異性。
[0112]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思做出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書(shū)所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種免疫層析試紙條，包括:樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊以及背襯板，所述硝酸纖維素膜包括檢測(cè)線與質(zhì)控線，其特征在于，所述硝酸纖維素膜還包括雙抗線。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述雙抗線設(shè)置于所述檢測(cè)線與所述質(zhì)控線之間。
3.如權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述雙抗線包括抗原，所述抗原為與待測(cè)物相同的純抗原溶液。
4.如權(quán)利要求3所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述雙抗線還包括與所述抗原對(duì)應(yīng)的抗體，所述抗原被所述抗體結(jié)合并固定在所述硝酸纖維素膜上。
5.如權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于，標(biāo)記抗體為膠體金、磁性納米粒子、量子點(diǎn)或上轉(zhuǎn)換納米材料中的一種。
6.—種如權(quán)利要求1-5所述的免疫層析試紙條的制作方法，其特征在于，所述制作方法包括以下步驟: (1)制作標(biāo)記抗體； (2)將所述標(biāo)記抗體固定于結(jié)合墊； (3)在硝酸纖維素膜上制作檢測(cè)線、雙抗線及質(zhì)控線； (4)制作樣品墊; (5)在背襯板上依次粘貼所述樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，各相鄰墊之間相互重疊約1.5mm。
7.如權(quán)利要求6所述的制作方法，其特征在于，步驟(3)中在硝酸纖維素膜上制作雙抗線包括以下步驟: (31)采用多克隆抗體溶液在所述硝酸纖維素膜的雙抗線區(qū)域噴一條待測(cè)物的抗體線，所述抗體線的寬度、長(zhǎng)度與所述檢測(cè)線的寬度、長(zhǎng)度相同； (32)用聚乙二醇(PEG)和N-羥基丁二酰亞胺(NHs)處理過(guò)的抗原溶液噴在所述雙抗線區(qū)域； (33)所述雙抗線區(qū)域發(fā)生抗原抗體的免疫反應(yīng)后，所述抗體的Fab端被抗原結(jié)合封閉，使得抗原分子通過(guò)抗原-抗體結(jié)合作用力而間接固定在所述硝酸纖維素膜上。
8.一種使用如權(quán)利要求1-5所述的免疫層析試紙條的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括以下步驟: (1)將待測(cè)樣品加入免疫層析試紙條的樣品墊； (2)采用檢測(cè)儀檢測(cè)免疫層析試紙條檢測(cè)線上的信號(hào)強(qiáng)度； (3)根據(jù)免疫層析試紙條的信號(hào)強(qiáng)度與濃度對(duì)應(yīng)的二次函數(shù)，以及步驟(2)中讀取的信號(hào)強(qiáng)度，得到所述信號(hào)強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的兩個(gè)濃度值，其中一個(gè)為位于所述二次函數(shù)曲線最高點(diǎn)左側(cè)的第一濃度值，另一個(gè)為位于所述最高點(diǎn)右側(cè)的第二濃度值； (4)比較所述免疫層析試紙條的雙抗線和質(zhì)控線的信號(hào)強(qiáng)度，如果所述雙抗線上的信號(hào)強(qiáng)度大于所述質(zhì)控線上的信號(hào)強(qiáng)度，則所述待測(cè)樣品中待測(cè)物的濃度為第一濃度值；如果所述雙抗線上的信號(hào)強(qiáng)度小于所述質(zhì)控線上的信號(hào)強(qiáng)度，則所述待測(cè)樣品中待測(cè)物的濃度為第二濃度值。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)中免疫層析試紙條的信號(hào)強(qiáng)度與濃度對(duì)應(yīng)的二次函數(shù)獲得的方法包括以下步驟: (31)配制一組濃度梯度的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)液，滴加到所述免疫層析試紙條的樣品墊上； (32)5?20分鐘后用檢測(cè)儀檢測(cè)硝酸纖維素膜上檢測(cè)線、雙抗線、質(zhì)控線的信號(hào)強(qiáng)度； (33)分別將步驟(32)中得到的信號(hào)強(qiáng)度及其所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物濃度進(jìn)行Log函數(shù)變換； (34)以變換后的待測(cè)物濃度值作X軸，以變換后的信號(hào)強(qiáng)度值作Y軸，分別作出檢測(cè)線、雙抗線及質(zhì)控線的標(biāo)準(zhǔn)曲線； (35)得出檢測(cè)線上信號(hào)強(qiáng)度與濃度對(duì)應(yīng)的二次函數(shù)公式。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種免疫層析試紙條，包括：樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊以及背襯板，硝酸纖維素膜包括檢測(cè)線與質(zhì)控線，硝酸纖維素膜還包括雙抗線。雙抗線設(shè)置于檢測(cè)線與質(zhì)控線之間。本發(fā)明提供的免疫層析試紙條及其制作方法與檢測(cè)方法，不僅保留了傳統(tǒng)免疫層析檢測(cè)試紙條操作簡(jiǎn)便、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、低成本的優(yōu)點(diǎn)，還有效避免了傳統(tǒng)試紙條在待測(cè)物高濃度時(shí)產(chǎn)生的假陰性現(xiàn)象，有效提高免疫層析法檢測(cè)的準(zhǔn)確性，擴(kuò)大了線性檢測(cè)范圍；不局限于檢測(cè)線的信號(hào)強(qiáng)度，而是綜合利用顯示區(qū)上三條線的信號(hào)強(qiáng)度以及三者信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系，因而能夠準(zhǔn)確地判斷待測(cè)物的濃度，大大提高了免疫層析檢測(cè)的靈敏度和特異性。
【IPC分類(lèi)】G01N33-558
【公開(kāi)號(hào)】CN104714008
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510058145
【發(fā)明人】王侃, 陳艷榮, 崔大祥, 何井華
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2015年2月4日