用于使用吡哆醛5’-磷酸-依賴性酶的改良高半胱氨酸測定法的n,n-二丁基-對-苯二胺與 ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 下文涉及用于定量測定血漿或血清中總高半胱氨酸的量及基于測量得到的總高 半胱氨酸存在量來評估疾病風(fēng)險(xiǎn)的組合物、方法和試劑盒。更具體地說，下文公開了涉及利 用高半胱氨酸酶及N，N-二丁基-對-苯二胺與吡哆醛5'磷酸的SchifT堿綴合物的二試 劑酶促高半胱氨酸測定法的實(shí)施方案。
【背景技術(shù)】
[0002] 心血管疾病在美國具有最高的死亡率，每年引起一百萬例心臟病發(fā)作和中風(fēng)死 亡。越來越多的研宄報(bào)告了正是總高半胱氨酸（tHCY)在心臟病和中風(fēng)，以及眾多其它疾病 中發(fā)揮至關(guān)重要作用。高同型半胱氨酸血癥是末期腎?。‥SRD)患者中的心血管疾病死亡 的一項(xiàng)主要風(fēng)險(xiǎn)因子，而且血漿tHCY可作為新腫瘤標(biāo)志物用于在化療期間監(jiān)測癌癥患者。 已經(jīng)報(bào)告了阿爾茨海默氏病患者和糖尿病個(gè)體可具有顯著升高的血漿tHCY。在其它疾病 諸如帕金森氏病中，高半胱氨酸可能發(fā)揮作用導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元易于功能障礙和死亡。 tHCY的濃度還可能與常見的妊娠并發(fā)癥和不利妊娠結(jié)局有關(guān)。測量tHCY水平通常可幫助 內(nèi)科醫(yī)師在妊娠過程中監(jiān)測胎兒和母親的健康。
[0003] 已經(jīng)開發(fā)了多種方法來測量血漿中的總高半胱氨酸（tHCY)。這些多種方法包括為 Abbott Mx分析儀設(shè)計(jì)的tHCY酶轉(zhuǎn)換免疫學(xué)測定法、微量滴定板tHCY酶促免疫測定法、使 用多種酶的高效液體層析（HPLC)方法測定法、和氣體層析-質(zhì)譜術(shù)方法。然而，這些方法 復(fù)雜，實(shí)施要求高度專門化的設(shè)備，而且通量有限。雖然已經(jīng)開發(fā)了不要求前述方法的專門 化設(shè)備的更簡單的四試劑單酶測定法，但是該四試劑測定法仍然比本文中公開的測定法更 加復(fù)雜。該四試劑測定法包括額外的試劑和步驟來測量tHCY。該四試劑方法更加昂貴，要 求更多時(shí)間來提供準(zhǔn)確讀數(shù)，而且不適用于當(dāng)前使用的大多數(shù)自動(dòng)化機(jī)器人分析儀。因此， 需要比先前方法更簡單、更便宜、更快速、且更容易實(shí)施的能測量tHCY量的tHCY測定法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本公開文本的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種測量總高半胱氨酸的方法，其包括下述步 驟：提供高半胱氨酸，用還原劑還原該高半胱氨酸，用高半胱氨酸酶（HCY酶）使該高半胱氨 酸發(fā)生酶促反應(yīng)，生成硫化氫（H 2S)，提供N，N-二丁基-對-苯二胺-吡哆醛5'-磷酸（N， N-dibutyl-p-phenylenediamine-pyridoxal 5'_phosphate) (DBPDA-PLP Schiff 喊），在含 Fe (III)化合物存在下將自該Schiff堿釋放的DBPDA-PLP與所述H2S組合，生成至少一種 生色團(tuán)，并用分光光度計(jì)或熒光讀數(shù)儀（熒光計(jì)）測量該至少一種生色團(tuán)。
[0005] 本公開文本的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種生成N，N-二丁基-對-苯二胺-吡哆 醛5' -磷酸的方法，其包括下述步驟：提供N，N-二丁基-對-苯二胺（DBPDA)在無水醇 (anhydrous alcohol)中的溶液，混合該溶液與R比唆醛5' -磷酸（PLP)溶液，生成混合物， 通過將該混合物的pH調(diào)節(jié)至大約4而形成沉淀物，并離心該沉淀物。
[0006] 本公開文本的又一個(gè)實(shí)施方案涉及一種生成N, N-二丁基-對-苯二胺-吡哆醛 5' -磷酸的備選方法，其包括下述步驟：提供N，N-二丁基-對-苯二胺（DBPDA)在無水醇 中的溶液，將該溶液添加至R比唆醛5' -磷酸（pyridoxal 5' -phosphate) (PLP)溶液，生成 混合物，并結(jié)晶該混合物。
[0007] 本公開文本的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種試劑盒，所述試劑盒包括：第一試劑，該第一 試劑包括還原劑、高半胱氨酸酶（HCY酶）與N，N-二丁基-對-苯二胺-吡哆醛5' -磷酸 的混合物；第二試劑，該第二試劑包括含F(xiàn)e (III)化合物；第一緩沖溶液；和第二緩沖溶液。
[0008] 本公開文本的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種用于檢測總高半胱氨酸（tHCY)依賴性的 不良狀況（total homocysteine dependent adverse condition)的風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法包 括下述步驟：自患者提取含高半胱氨酸的血漿或血清，用還原劑還原結(jié)合的高半胱氨酸，用 高半胱氨酸酶（HCY酶）使該高半胱氨酸發(fā)生酶促反應(yīng)，生成硫化氫（H 2S)，提供N，N-二丁 基-對-苯二胺-吡哆醛5' -磷酸（DBPDA-PLP Schiff堿），在含F(xiàn)e (III)化合物存在下 將自該SchifT堿釋放的DBPDA與所述H2S組合，生成至少一種生色團(tuán)，并用分光光度計(jì)測 量該至少一種生色團(tuán)。
[0009] 本公開文本的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種組合物，該組合物包含與吡哆醛5' -磷酸 綴合的N，N-二丁基-對-苯二胺。
[0010] 附圖簡述
[0011] 下面參照下述附圖詳細(xì)描述一些實(shí)施方案，其中同樣的名稱表示同樣的成員，其 中：
[0012] 圖1描繪流程圖，其描述用于自高半胱氨酸合成生色團(tuán)的方法的一個(gè)實(shí)施方案；
[0013] 圖2描繪與吡哆醛5'磷酸綴合的N，N-二丁基-對-苯二胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)的一個(gè)實(shí) 施方案；
[0014] 圖3描繪流程圖，其描繪將N，N-二丁基-對-苯二胺與吡哆醛5'磷酸綴合的方 法步驟的一個(gè)實(shí)施方案；
[0015] 圖4描繪將N, N-二丁基-對-苯二胺與吡哆醛5'磷酸綴合的備選方法的一個(gè)實(shí) 施方案的流程圖；
[0016] 圖5描繪示意圖，其比較二試劑總高半胱氨酸測定法和利用四種試劑的總高半胱 氨酸測定法的實(shí)施方案的結(jié)果；
[0017] 圖6描繪二試劑tHCY測定法的一個(gè)實(shí)施方案的方案的流程圖；
[0018] 圖7描繪tHCY測定法的一個(gè)實(shí)施方案的線性的示意圖。
[0019] 圖8描繪Bland Altman分析的示意圖，該分析比較tHCY測定法的二試劑實(shí)施方 案與四試劑測定法的準(zhǔn)確度，在±2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)。 具體實(shí)施方案
[0020] 參照附圖，提供例示而非限制，本文中呈現(xiàn)所公開的裝置和方法的下文所述實(shí)施 方案的詳述。雖然顯示和詳述了某些實(shí)施方案，但是應(yīng)當(dāng)理解可進(jìn)行各種變化和變更而不 偏離所附權(quán)利要求書的范圍。本公開文本的范圍絕非會(huì)限于構(gòu)成成分的數(shù)目、其材料、其形 狀、其相對排列、等，而且僅僅作為本公開文本的各實(shí)施方案的一個(gè)例子公開。
[0021] 作為詳述的前言，應(yīng)當(dāng)注意，如本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式 "一個(gè)"和"一種"包括復(fù)數(shù)所指物，除非上下文另有明確說明。
[0022] 生物學(xué)流體中升高的tHCY可能是已知展現(xiàn)異常水平的tHCY的不良疾病的風(fēng)險(xiǎn)因 子。生物學(xué)流體中tHCY的正常水平為大約5至15 μ mol/L，而且大于15 μ mol/L的濃度可 視為異常。tHCY濃度升高的個(gè)體可能有風(fēng)險(xiǎn)的不良狀況和疾病包括但不限于心血管疾病 (特別是在可具有末期腎病（ESRD)的個(gè)體中）、心臟病、中風(fēng)、糖尿病、抑郁、帕金森氏病、阿 爾茨海默氏病、和維生素缺乏（特別是B 6、B12和葉酸缺乏）。tHCY定量測量作為腫瘤標(biāo)志 物用于在化療期間監(jiān)測癌癥患者也可能是有用的。而且，生物學(xué)流體中的tHCY濃度可提供 關(guān)于其它多種健康相關(guān)問題諸如應(yīng)激、吸煙和衰老的信息。
[0023] 圖1描繪用于測定生物學(xué)流體中總高半胱氨酸（tHYC)濃度的測定法100的一個(gè) 實(shí)施方案。測定法100測量含高半胱氨酸的生物學(xué)流體的tHCY濃度。該tHCY測定法用于 生物學(xué)樣品的體外診斷。使用測定法100收集和分析的生物學(xué)流體的一些例子包括尿液、 組織液、血液、血清、或血漿。
[0024] 在例示性實(shí)施方案中，EDTA或肝素-血漿/血清可用于該tHCY測定法。紅細(xì)胞 在采樣后會(huì)合成tHCY，因此血漿或血清與血細(xì)胞的分離應(yīng)當(dāng)在一小時(shí)內(nèi)實(shí)施。一種備選做 法是使用抑制劑3-脫氮腺苷（3-deazaadenosine，3-DA)，它會(huì)抑制紅細(xì)胞生成HCY且容許 全血無需分離而長期保存。3-DA不干擾HCY酶，因此可用于tHCY測定法的任何使用HCY 酶的實(shí)施方案。分離可使用離心來實(shí)施。在這個(gè)例子中，可將收集的生物學(xué)流體以300x g 離心5分鐘。在本文所述一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，可取出100 μ 1生物學(xué)流體的最小體積樣 品。生物學(xué)流體可以在有或無EDTA或肝素的情況下收集。生物學(xué)樣品應(yīng)當(dāng)保持低溫（大約 4-8°C)，直至分離。在無菌條件下，血漿/血清樣品可于4-8°C保存大約四周。對于更長的 保存