生色團(tuán)的熒光。在例示性 實(shí)施方案中，可在大約700-710nm的發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)量生色團(tuán)的濃度。
[0038] 可以使用兩種試劑在兩個(gè)同時(shí)進(jìn)行的步驟中實(shí)施tHCY測(cè)定法100的實(shí)施方案。 在這種兩步實(shí)施方案中，可首先使生物學(xué)流體中的tHCY與第一試劑（試劑I)反應(yīng)。試劑 I可以是還原劑、高半胱氨酸酶和顯色劑的組合。在一些實(shí)施方案中，試劑I可包括作為還 原劑的DTT、作為高半胱氨酸酶的rHCY酶和作為顯色劑的DBPDA-PLP。在tHCY測(cè)定法的 這個(gè)實(shí)施方案中，在第一試劑與生物學(xué)流體組合時(shí)，還原劑可將高半胱氨酸的二硫鍵還原 成硫氫鍵。相應(yīng)地，高半胱氨酸酶可開(kāi)始與還原的高半胱氨酸反應(yīng)，通過(guò)上文所述的酶促反 應(yīng)生成H 2S,而且可包括副產(chǎn)物諸如氨和α-酮基丁酸。所得H2S隨后結(jié)合顯色劑，諸如自 DBPDA-PLP 釋放的 DBPDA，生成生色團(tuán)原（pre-chromophore)。
[0039] -旦作為試劑I和生物學(xué)流體之間多數(shù)反應(yīng)的產(chǎn)物生成了生色團(tuán)原，可將第二試 劑（試劑II)添加至所得生色團(tuán)原。在例示性實(shí)施方案中，試劑I完成與生物學(xué)流體反應(yīng) 以生成生色團(tuán)原所花費(fèi)的時(shí)間量可少至大約五分鐘。在形成生色團(tuán)原之后，tHCY測(cè)定法的 第二步可包括組合第二試劑與生色團(tuán)原以生成生色團(tuán)。試劑II可以是任何能夠?qū)⑸珗F(tuán) 原氧化成生色團(tuán)的氧化劑。在一些實(shí)施方案中，試劑II可以是含F(xiàn)e(III)化合物。例如，氧 化劑可以是氯化鐵（FeCl3)、鐵氰酸鉀（K3Fe(CN)6)、氧化鐵（Fe 2O3)、氟化鐵（FeF3)、溴化鐵 (Fefc3)、或碘化鐵（FeI 3)。試劑II還可以包括強(qiáng)酸溶劑諸如HI、HBr ? HC104、HC1、HC103、 &504或HNO 3。所得的生色團(tuán)可以如先前所述使用分光光度計(jì)或熒光讀數(shù)儀來(lái)測(cè)量。
[0040] 下文表1提供比較該二試劑實(shí)施方案的用于測(cè)量tHCY的測(cè)定法與一種利用四種 試劑來(lái)計(jì)算tHCY的方法之間的差異的一個(gè)例子。如表1中的比較所示，相比于四試劑tHCY 測(cè)定法中的未綴合DBPDA，該二試劑測(cè)定法通過(guò)納入顯色劑DBPDA-PLP可以獲得顯著的效 益。四試劑測(cè)定法中的DBPDA可能與rHCY酶不相容，因此四試劑測(cè)定法要求每種試劑分開(kāi) 供應(yīng)。然而，二試劑實(shí)施方案通過(guò)使用綴合DBPDA-PLP實(shí)現(xiàn)了相對(duì)于單獨(dú)的DBPDA的出乎 意料的優(yōu)勢(shì)。DBPDA-PLP穩(wěn)定且與rHCY酶相容，從而允許將顯色劑--高半胱氨酸酶和還 原劑組合成一種試劑，與將諸成分各自分開(kāi)的實(shí)施方案形成對(duì)比。
[0041] 表1 :二試劑和四試劑tHCY測(cè)定法之間的差異
[0042]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)量總高半胱氨酸的方法，其包括下述步驟： 提供高半胱氨酸； 用還原劑還原該高半胱氨酸； 用高半胱氨酸酶（HCY酶）使該高半胱氨酸發(fā)生酶促反應(yīng)，生成硫化氫（H2S);提供N,N-二丁基-對(duì)-苯二胺-吡哆醛 5' -磷酸（DBPDA-PLPSchiff堿）； 在含F(xiàn)e(III)的化合物的存在下將自該DBPDA-PLP釋放的DBPDA與所述H2S組合，生 成至少一種生色團(tuán)；并 測(cè)量該至少一種生色團(tuán)。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中該高半胱氨酸酶為L(zhǎng)-高半胱氨酸a，Y-裂合酶（rHCY 酶）。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述用HCY酶使高半胱氨酸發(fā)生酶促反應(yīng)生成H2S的步驟 在大約五分鐘內(nèi)發(fā)生。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述在含F(xiàn)e(III)的化合物的存在下將自DBPDA-PLP釋放 的DBPDA與H2S組合的步驟在大約五分鐘內(nèi)生成所述至少一種生色團(tuán)。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中該含F(xiàn)e(III)的化合物為FeCl3。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中該還原劑為二硫蘇糖醇（DTT)。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述測(cè)量至少一種生色團(tuán)的步驟通過(guò)在大約660nm測(cè)量該 生色團(tuán)的吸光度來(lái)實(shí)施。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中所述測(cè)量至少一種生色團(tuán)的步驟通過(guò)在大約660nm測(cè)量該 生色團(tuán)的熒光的激發(fā)光譜來(lái)實(shí)施。
9. 權(quán)利要求1的方法，其中測(cè)量至少一種生色團(tuán)的步驟通過(guò)在大約700nm測(cè)量該生色 團(tuán)的熒光的發(fā)射光譜來(lái)實(shí)施。
10. -種生成N，N-二丁基-對(duì)-苯二胺-吡哆醛5' -磷酸的方法，其包括下述步驟： 提供N，N-二丁基-對(duì)-苯二胺（DBPDA)在無(wú)水醇中的溶液； 混合該溶液與吡哆醛5' -磷酸（PLP)溶液，生成混合物； 通過(guò)將該混合物的pH調(diào)節(jié)至大約4. 0而形成沉淀物；并 離心該沉淀物。
11. 權(quán)利要求10的方法，其包括下述額外步驟： 在酸性水中懸浮該沉淀物； 第二次離心該沉淀物；并 在真空中在P2O5上干燥該沉淀物。
12. 權(quán)利要求10的方法，其中該無(wú)水醇為無(wú)水乙醇。
13. 權(quán)利要求11的方法，其中該酸性水具有大約4. 5的pH。
14. 一種生成N，N-二丁基-對(duì)-苯二胺-吡哆醛5' -磷酸的方法，其包括下述步驟： 提供N，N-二丁基-對(duì)-苯二胺（DBPDA)在無(wú)水醇中的溶液； 將該溶液添加至吡哆醛5' -磷酸（PLP)溶液，生成混合物；并 結(jié)晶該混合物。
15. 權(quán)利要求14的方法，其進(jìn)一步包括下述步驟： 用醇清洗結(jié)晶的混合物；并 凍干結(jié)晶的混合物。
16. 權(quán)利要求14的方法，其中該無(wú)水醇為無(wú)水乙醇。
17. 權(quán)利要求15的方法，其中所述醇為75%乙醇。
18. -種試劑盒，其包括： 第一試劑，該第一試劑包括還原劑、高半胱氨酸酶（HCY酶）及N，N-二丁基-對(duì)-苯二 胺-吡哆醛5' -磷酸的混合物； 第二試劑，該第二試劑包括含F(xiàn)e(III)的化合物； 第一緩沖溶液；和 第二緩沖溶液。
19. 權(quán)利要求18的試劑盒，其中該HCY酶為L(zhǎng)-高半胱氨酸a，Y-裂合酶。
20. 權(quán)利要求18的試劑盒，其中該含F(xiàn)e(III)的化合物為FeCl3。
21. 權(quán)利要求18的試劑盒，其中該第一緩沖溶液為磷酸鈉緩沖液。
22. 權(quán)利要求21的試劑盒，其中該第一緩沖溶液進(jìn)一步包括非離子型表面活性劑。
23. 權(quán)利要求18的試劑盒，其中該第二緩沖溶液為強(qiáng)酸。
24. 權(quán)利要求22的試劑盒，其中該非離子型表面活性劑為T(mén)ritonX-100。
25. 權(quán)利要求18的試劑盒，其進(jìn)一步包括至少一種校準(zhǔn)物和至少一種對(duì)照。
26. 權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述至少一種校準(zhǔn)物和所述至少一種對(duì)照各自為含已 知濃度的總高半胱氨酸的基質(zhì)血漿。
27. -種用于檢測(cè)總高半胱氨酸（tHCY)依賴(lài)性的不良狀況的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其包括下述 步驟： 自患者提取含高半胱氨酸的血漿或血清； 用還原劑還原該高半胱氨酸； 用高半胱氨酸酶（HCY酶）使該高半胱氨酸發(fā)生酶促反應(yīng)，生成硫化氫（H2S);提供N,N-二丁基-對(duì)-苯二胺-吡哆醛 5' -磷酸（DBPDA-PLPSchiff堿）； 在含F(xiàn)e(III)的化合物存在下將自該DBPDA-PLP釋放的DBPDA與所述H2S組合，生成 至少一種生色團(tuán)；并 測(cè)量該至少一種生色團(tuán)，其中測(cè)量至少一種生色團(tuán)的步驟測(cè)定5-15ymol/L或大于 15ymol/L的tHCY濃度。
28. 權(quán)利要求27的方法，其中所述tHCY依賴(lài)性的不良狀況為心血管疾病、中風(fēng)、阿爾茨 海默氏病、帕金森氏病、糖尿病、癌癥、腎衰竭、或其它疾病。
29. -種組合物，其包含： 與吡哆醛5' -磷酸綴合的N，N-二丁基-對(duì)-苯二胺。
【專(zhuān)利摘要】本申請(qǐng)?zhí)峁┯糜谑褂眠炼呷?'-磷酸依賴(lài)性酶的改良高半胱氨酸測(cè)定法的N,N-二丁基-P-苯二胺與吡哆醛5'-磷酸的SCHIFF堿綴合物。具體地，本申請(qǐng)?zhí)峁┯糜趯?shí)施二試劑酶促高半胱氨酸測(cè)定法的組合物、方法和試劑盒，其中使用一種酶高半胱氨酸酶和N,N-二丁基-對(duì)-苯二胺(DBPDA)與吡哆醛5’-磷酸(PLP)的Schiff堿綴合物來(lái)測(cè)量血漿或血清中的總高半胱氨酸。該測(cè)定法測(cè)量在含F(xiàn)e+3化合物存在下H2S與自該Schiff堿綴合物釋放的DBPDA的生色團(tuán)反應(yīng)產(chǎn)物。所得的生色團(tuán)可通過(guò)吸光度或熒光分光光度法來(lái)測(cè)量。
【IPC分類(lèi)】G01N21-31, G01N21-64
【公開(kāi)號(hào)】CN104777107
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510013210
【發(fā)明人】Y·譚, S·李
【申請(qǐng)人】抗癌公司
【公開(kāi)日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2015年1月12日