一種冠心丹參膠囊指紋圖譜的建立方法及其指紋圖譜的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種冠心丹參膠囊指紋圖譜的建立方法及其指紋圖譜，屬于中藥分析領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]冠心丹參膠囊由丹參、三七、降香油組成，具有活血化瘀、理氣止痛等功效，臨床主要用于治療氣滯血瘀所致的胸痹心痛。冠心丹參膠囊用于氣滯血瘀型冠心病所致的胸悶、胸痛、心悸氣短。對(duì)垂體后葉素引起的大鼠心電圖缺血性改變有一定的作用，可降低血清磷酸肌酸和乳酸脫氫酶，減少心肌組織中丙二醛的生成，保護(hù)心肌組織超氧化物歧化酶的活性，增強(qiáng)注射異丙腎上腺素小鼠耐缺氧的能力。中國藥典(2010年版)以丹參酮II A為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)該藥進(jìn)行定量控制。然而，丹參中水溶性物質(zhì)對(duì)心腦血管疾病也具有良好的效果，如丹參素能明顯擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈使其血流量顯著增加；原兒茶醛具有擴(kuò)張動(dòng)脈、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集等作用，酚酸成分具有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基等作用。因此，丹參水溶性物質(zhì)含量的高低也將影響冠心丹參膠囊的療效，以上多種成分同時(shí)定量控制能更好地表征冠心丹參膠囊的質(zhì)量。
[0003]近年來，關(guān)于冠心丹參制劑質(zhì)量控制方法的報(bào)道較多，主要有薄層色譜鑒別、分光光度法、液相色譜-紫外分光光度法(HPLC-UV)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法等。魏惠珍等在《HPLC同時(shí)測(cè)定冠心丹參膠囊中丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B和丹參酮A的含量》一文中建立了一種同時(shí)測(cè)定丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮II A4種指標(biāo)成分的含量測(cè)定方法，可用于冠心丹參膠囊的質(zhì)量控制和治療藥物監(jiān)測(cè)。黃喜茹等在《冠心丹參制劑的質(zhì)量控制方法研宄》中建立反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定冠心丹參制劑中3種丹參脂溶性成分隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的含量。劉亞東等在《HPLC法測(cè)定冠心丹參膠囊中隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮II A含量》建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定冠心丹參膠囊中隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮II A含量的方法，方法簡便快捷、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。雖然目前對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與藥理臨床研宄較多，但其廣泛而顯著的藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)還有待進(jìn)一步深入研宄，其質(zhì)量控制方法也需要更精細(xì)更全面的更全面的控制方法研宄。
[0004]中藥指紋圖譜是指通過現(xiàn)代的分析檢測(cè)方法對(duì)中藥復(fù)雜的物質(zhì)體系進(jìn)行分析，并盡可能全面地獲得中藥中多個(gè)化學(xué)成分的化學(xué)特征圖譜，并通過特征峰的有無及各峰之間的強(qiáng)度比來對(duì)中藥中化學(xué)成分進(jìn)行定性和定量分析，用于中藥的質(zhì)量控制和新藥研發(fā)的物質(zhì)基礎(chǔ)的信息表征手段和方法；中藥指紋圖譜是建立在對(duì)中藥中化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)全面研宄的基礎(chǔ)上的一種多方面的，可量化的鑒定手段，具有宏觀、整體評(píng)價(jià)和模糊分析等特點(diǎn)，特別適合于中藥復(fù)雜體系的整體研宄。中藥指紋圖譜是目前已經(jīng)成為一種能被國內(nèi)外學(xué)者廣泛接受的質(zhì)量控制模式，日本、美國FDA、世界衛(wèi)生組織等都允許使用指紋圖譜作為單味藥材提取物的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，而在國內(nèi)中藥的指紋圖譜也成為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的研宄熱點(diǎn)。HPLC指紋圖譜具有分離效果好、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快、結(jié)果重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，是中藥指紋圖譜研宄應(yīng)用較多的方法之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有冠心丹參膠囊質(zhì)量控制方法的不足，提供一種HPLC指紋圖譜的建立方法及用該方法所得的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。其特點(diǎn)是將冠心丹參膠囊制備成供試品溶液，經(jīng)過HPLC分離檢測(cè)，獲得冠心丹參膠囊HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。本研宄采用高效液相色譜法對(duì)冠心丹參膠囊指紋圖譜進(jìn)行了研宄，并應(yīng)用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件”對(duì)不同批號(hào)的冠心丹參膠囊指紋圖譜相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，采用本發(fā)明方法所建立的冠心丹參膠囊指紋圖譜具有分離效果好，檢測(cè)靈敏度高，結(jié)果重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，可為冠心丹參膠囊的真?zhèn)舞b別和內(nèi)在質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。
[0006]一種冠心丹參膠囊指紋圖譜的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步驟:
[0007](I)供試品溶液的制備:精密稱取冠心丹參膠囊內(nèi)容物I?20g，加70%甲醇25?500ml，超聲20?40min溶解后，冷卻后取少量上清液過0.45 μ m微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0008](2)對(duì)照品溶液的制備:精密稱取丹參素鈉、迷迭香酸、丹酚酸B、原兒茶醛、二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮1、丹參酮IIA適量，分別用50%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇溶解成濃度分別為200 μ g/ml的溶液，再吸取對(duì)照品溶液各適量，用甲醇稀釋成濃度分別為50 μ g/ml的對(duì)照品溶液；
[0009](3)色譜條件:十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，250X4.6mm ;流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液_乙腈；采用梯度洗脫方式Omin — 40min — 42min — 60min — 65min — 95min，甲醇 10% — 40% — 60% — 70% — 95%— 95%;流速 0.8ml/min ;柱溫 25 ?35°C;檢測(cè)波長:270nm ;進(jìn)樣量為10?20 μ I ;
[0010](4)供試品溶液的測(cè)定:精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測(cè)定，得到冠心丹參膠囊的HPLC-UV圖譜；
[0011](5)HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制作按照上述方法對(duì)10批供試品溶液和對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測(cè)定，記錄色譜圖，得到10批冠心丹參膠囊的圖譜；并進(jìn)行分析比較，得到由測(cè)定所得的指紋圖譜中有11個(gè)共有峰，這些共有特征峰構(gòu)成了冠心丹參膠囊的指紋特征，圖譜經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件計(jì)算，相似度大于
0.9 ;是冠心丹參膠囊標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，所述的冠心丹參膠囊標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如附圖1所示。
[0012]其中，以5號(hào)峰即丹酚酸B為參照物峰，各峰的相對(duì)保留時(shí)間為:峰I丹參素鈉:相對(duì)保留時(shí)間0.206 ;峰2原兒茶醛:相對(duì)保留時(shí)間0.370 ;峰3迷迭香酸:相對(duì)保留時(shí)間
0.894 ;峰4:相對(duì)保留時(shí)間0.924 ;峰5丹酚酸B:相對(duì)保留時(shí)間1.000 ;峰6:相對(duì)保留時(shí)間
1.070 ;峰7:相對(duì)保留時(shí)間1.716 ;峰8 二氫丹參酮:相對(duì)保留時(shí)間1.892 ;峰9隱丹參酮:相對(duì)保留時(shí)間2.101 ;峰10丹參酮1:相對(duì)保留時(shí)間2.148 ;峰11丹參酮IIA:相對(duì)保留時(shí)間 2.422。
[0013]優(yōu)選地，所述的冠心丹參膠囊標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，以5號(hào)峰即丹酚酸B為參照物峰，各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積分別為:
[0014]峰I丹參素鈉:相對(duì)保留時(shí)間0.206，相對(duì)峰面積0.104 ；
[0015]峰2原兒茶醛:相對(duì)保留時(shí)間0.370，相對(duì)峰面積0.097 ；
[0016]峰3迷迭香酸:相對(duì)保留時(shí)間0.894，相對(duì)峰面積0.090 ；
[0017]峰4:相對(duì)保留時(shí)間0.924，相對(duì)峰面積0.080 ；
[0018]峰5丹酚酸B:相對(duì)保留時(shí)間1.000，相對(duì)峰面積1.000 ；
[0019]峰6:相對(duì)保留時(shí)間1.070，相對(duì)峰面積0.179 ；
[0020]峰7:相對(duì)保留時(shí)間1.716，相對(duì)峰面積0.017 ；
[0021]峰8 二氫丹參酮:相對(duì)保留時(shí)間1.892，相對(duì)峰面積0.047 ；
[0022]峰9隱丹參酮:相對(duì)保留時(shí)間2.101，相對(duì)峰面積0.239 ；
[0023]峰10丹參酮1:相對(duì)保留時(shí)間2.148，相對(duì)峰面積0.145 ；
[0024]峰11丹參酮IIA:相對(duì)保留時(shí)間2.422，相對(duì)峰面積0.602 ；
[0025]實(shí)驗(yàn)例I HPLC-UV紫外檢測(cè)波長的選擇
[0026]冠心丹參膠囊的組方有三七、丹參、降香三味藥材，各藥味的化學(xué)成分復(fù)雜，各成分的色譜行為及儀器的響應(yīng)值也是迥乎不同，因此應(yīng)在整體全面的原則下對(duì)測(cè)定波長進(jìn)行選擇。取供試品溶液20 μ 1，注入液相色譜儀，采用二極管陣列檢測(cè)器篩選波長，對(duì)樣品進(jìn)行190-400nm全波長掃描，結(jié)果見圖2樣品三維紫外吸收?qǐng)D和圖3樣品的等高線圖。由樣品的三維紫外吸收?qǐng)D和等高線圖可見，樣品中主要成分在200nm?360nm的紫外吸收較強(qiáng)，分別比較了 190nm、203nm、254nm、270nm、330nm、360nm的樣品紫外吸收光譜圖，結(jié)果270nm為檢測(cè)波長檢出的樣品信息量較多，其分離度、峰形和柱效及出峰的穩(wěn)定性較為滿意，故選擇270nm為檢測(cè)波長。
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