一種河豚毒素的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種中國鱟和圓尾鱟體內(nèi)的河豚毒素的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中國鱟主要分布于日本的瀨戶內(nèi)海和九州島北岸，越南、西菲律賓的島嶼，蘇門達臘和爪哇島，馬來西亞的北婆羅洲以及加里曼丹東岸等海域，在中國主要分布于長江以南的浙江、福建、廣東、廣西、海南以及臺灣等沿海海域，現(xiàn)以福建、廣東、廣西、海南為多。圓尾鱟分布于中國香港、北部灣、雷州灣、印度尼西亞爪哇島北岸以北、菲律賓南部以西和恒河河口印度東北部以東的海域。在我國圓尾鱟主要分布于北部灣、雷州半島西海岸以及海南的西海岸，近年來發(fā)現(xiàn)雷州半島南海岸及以東沿岸均有圓尾鱟的分布，如湛江、香港等地不少海灘也分布有不少的圓尾鱟。我國人民素有吃鱟的習慣，鱟肉似蟹，只是口感較粗。在中國的廣東、廣西常有食鱟中毒的事件發(fā)生。
[0003]河豚毒素(tet1dotoxin，TTX)是一種毒性很強的神經(jīng)性毒素，它最早從河豚魚中分離出來的。近年來還發(fā)現(xiàn)河豚毒素不僅存在于河豚屬的魚類，還存在于蝦虎魚、章魚、海星、蟹類以及腹足類，甚至還有鱟等眾多的海洋生物中。它們不僅本身有較強的毒性而且可以通過食物鏈富集等途徑，污染其他水產(chǎn)品，給人們食用這些水產(chǎn)品構(gòu)成極大潛在危險。在東南亞河豚毒素中毒已經(jīng)成為一個難題，一般都是因為攝取了河豚魚導致的中毒。因為在日本河豚魚被作為一道佳肴，所以大多數(shù)的河豚中毒事件都是發(fā)生在日本。另外，誤食不明魚種也是此類中毒事件發(fā)生的重要原因，因而加強對水產(chǎn)品中河豚毒素的監(jiān)測顯得尤為必要，多省地方漁業(yè)局已將水產(chǎn)品中河豚毒素作為常規(guī)檢測項目。河豚毒素的檢測方法種類繁多，有生物測定法、理化檢測方法、免疫化學測定方法等幾大類。小鼠法是最常用和最簡便的方法，廖永巖等也在2000年用小白鼠法檢測了中國鱟和圓尾鱟體內(nèi)的河豚毒素，但此法具有定量不準確且重復性差等缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種檢測中國鱟和圓尾鱟體內(nèi)的河豚毒素的方法。
[0005]其技術(shù)方案如下:
[0006]一種中國鱟和圓尾鱟體內(nèi)的河豚毒素的檢測方法，包括以下步驟:
[0007](I)標準貯備液的配制
[0008]精密稱量TTX 1.0mg置于5ml離心管中，用Iml移液槍吸取1.0mL的濃度為0.2%醋酸，使其溶解后即得1.0mg/mL的TTX貯備溶液，置于冰箱中保存；
[0009](2)樣品的前處理
[0010]取中國鱟或圓尾鱟待測組織10g，剪碎后加1ml pH = 3.5濃度為0.1 %的醋酸于玻璃勻漿器中勻漿，充分勻漿后將樣品置于燒瓶中，加50ml濃度為0.1 %的醋酸，然后在水浴鍋中沸水浴10-20分鐘，邊加熱邊攪拌，轉(zhuǎn)速控制在150-200r/min，冷卻后用0.45 ym濾膜真空抽濾，將濾液放入蒸發(fā)皿中，在60-70°C的水浴鍋上進行蒸發(fā)濃縮，直至10ml，然后過濾定溶至10ml，將濃縮的濾液10ml放在離心管中，經(jīng)10000r/min的速度，離心15分鐘，取上清液經(jīng)0.22 ym的微孔濾膜過濾后，放入干凈的離心管中，作為液相色譜待測液；
[0011](3)液相色譜測試
[0012]醋酸流動相色譜條件固定相:SunFire?C18色譜柱，直徑4.6mmX長度150mm，進樣量為20 y ;流動相:0.2%醋酸；流速:0.8mL/min ;紫外檢測波長:210nm ;柱溫:25°C ;每次進樣體積為60 y L ;pH為3.0 ;
[0013]磷酸流動相色譜條件固定相:SunFire?C18色譜柱，尺寸為4.6_X 150_，進樣量為 20 y 1 ;流動相:0.05mol/L NaH2P04_0.05mol/L Na2HP04，pH = 6.8，庚烷磺酸鈉離子對5mM ;流速:lmL/min ;紫外檢測波長為200nm ;柱溫:25°C;每次進樣體積為60 y L ;pH為6.8。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果:
[0015]1、本發(fā)明采用高效液相色譜法檢測中國鱟和圓尾鱟體內(nèi)的的河豚毒素，以便證明鱟體內(nèi)的毒素到底是不是含有河豚毒素，從而知道是食什么鱟引起食鱟中毒以及含量多少，為食鱟中毒的預防和治療提供參考。
[0016]2、本發(fā)明樣品前處理步驟中，水浴鍋中沸水浴10-20分鐘，邊加熱邊攪拌，轉(zhuǎn)速控制在150-200r/min，在這一范圍內(nèi)，物料粘度不會隨著攪拌的進行而增大，如果轉(zhuǎn)速過高，粘度增大后轉(zhuǎn)速會逐漸降低會影響河豚毒素的溶出。
【附圖說明】
[0017]圖1是0.2%的醋酸(pH = 3.0)做流動相的河豚毒素標準樣液相色譜圖。
[0018]圖2 是 0.05mol/LNaH2P04-0.05mol/L Na2HP04 (pH = 6.8)以及庚烷磺酸鈉離子對5mM做流動相的河豚毒素標準樣液相色譜圖。
[0019]圖3是磷酸做流動相的河豚毒素標準樣液相色譜圖。
[0020]圖4是0.2 %的醋酸(pH = 3.0)做流動相的溶解物液相色譜圖。
[0021]圖5是以磷酸緩沖液為流動相作為標準液，全波段掃描的紫外光譜圖。
[0022]圖6是以0.2%的醋酸溶液溶解為流動相作為標準液，全波段掃描的紫外光譜圖。
[0023]圖7是以0.2%醋酸溶解的河豚毒素標準樣，全波段掃描的紫外光譜圖。
[0024]圖8是以中國鱟的肌肉樣品溶液為代表，對抽提的樣品進行全波段掃描的紫外光譜圖。
[0025]圖9是以圓尾鱟的肌肉樣品溶液為代表，對抽提的樣品進行全波段掃描的紫外光譜圖。
[0026]圖10是對標準品分別選用194、198、200、204、214nm等5種波長進行色譜檢測。
[0027]圖11是以磷酸流動相、200nm紫外波長條件下，進行0.2%醋酸和河豚毒素標準樣的色譜檢測。
[0028]圖12是將河豚毒素標準樣、中國鱟肌肉、圓尾鱟肌肉色譜圖進行比較。
[0029]圖13是將河豚毒素標準樣、中國鱟黃色結(jié)締組織、圓尾鱟黃色結(jié)締組織色譜圖進行比較。
[0030]圖14將河豚毒素標準樣、中國鱟肌肉、圓尾鱟肌肉色譜圖色譜峰的高矮進行比較.
[0031]圖15將河豚毒素標準樣、中國鱟黃色結(jié)締組織、圓尾鱟黃色結(jié)締組織色譜圖進行色譜峰高矮的比較。
【具體實施方式】
:
[0032]下面以實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。
[0033]材料與方法
[0034]中國鱟的成鱟購于湛江海鮮批發(fā)市場；圓尾鱟成鱟采自湛江東海島民安海區(qū)。
[0035]儀器
[0036]日本島津EL-120HA電子天平(感量0.0lg)，日本島津AY120電子天平(感量
0.0OOlg)，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司GM-0.33 II真空隔膜抽濾機，科大創(chuàng)新股份有限公司KDC-160H高度冷凍離心機。日本島津LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津STO-20A可見-紫外檢測器，SunFire?C18色譜柱(4.6mmX 150mm)，意大利哈納HI8424 pH計，北京普析通用儀器有限公司TU1901紫外-可見分光光度計。
[0037]試劑
[0038]河豚毒素，經(jīng)北京畢特博生物有限公司，從美國ENZO公司進口，純度大于99%。庚烷磺酸鈉，冰醋酸、NaH2POjP Na 2ΗΡ04均為分析純，甲醇為色譜純，購自湛江林達公司。超純水自制。
[0039]方法
[0040]標準貯備液的配制
[0041]精密稱量TTX 1.0mg置于5ml離心管中，用Iml移液槍吸取1.0mL的醋酸(0.2% )，使其溶解后即得1.0mg/mL的TTX貯備溶液，置于冰箱中保存。
[0042]樣品的前處理
[0043]參照周昕等的方法進行改良的河豚毒素抽提法進行樣品處理:取中國鱟或圓尾鱟待測組織10g，剪碎后加1ml 0.1%的醋酸(pH = 3.5)于玻璃勻漿器中勻漿。充分勻漿后將樣品置于燒瓶中，加50ml醋酸(0.1%)，然后在水浴鍋中沸水浴10-20分鐘，邊加熱邊攪拌，轉(zhuǎn)速控制在150-200r/min。冷卻后用0.45 μ m濾膜真空抽濾，將濾液放入蒸發(fā)皿中，在60-70 °C的水浴鍋上進行蒸發(fā)濃縮，直至10ml，然后過濾定溶至10ml。將濃縮的濾液1ml放在離心管中，經(jīng)10000r/min的速度，離心15分鐘。取上清液經(jīng)0.22 μ m的微孔濾膜過濾后，放入干凈的離心管中，作為液相色譜待測液。中國鱟、圓尾鱟組織共進行2次取樣抽提。
[0044]色譜條件
[0045]醋酸流動相色譜