條件固定相:SunFire?C18色譜柱，直徑4.6mmX長(zhǎng)度150mm，進(jìn)樣量為20 μ ;流動(dòng)相:0.2%醋酸；流速:0.8mL/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):21nm ;柱溫:25°C ;每次進(jìn)樣體積為60 μ L ;pH為3.0 ;
[0046]磷酸流動(dòng)相色譜條件固定相:SunFire?C18色譜柱，尺寸為4.6mmX 150mm，進(jìn)樣量為 20 μ I ;流動(dòng)相:0.05mol/L NaH2PO4-0.05mol/L Na2HPO4, pH = 6.8，庚烷磺酸鈉離子對(duì)5mM ;流速:lmL/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為200nm ;柱溫:25°C;每次進(jìn)樣體積為60 μ L ;pH為6.8。
[0047]結(jié)果與分析
[0048]流動(dòng)相的確定
[0049]在實(shí)驗(yàn)中首先選擇0.2%的醋酸(pH = 3.0)做流動(dòng)相，對(duì)河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行液相色譜分析，結(jié)果如圖1。
[0050]從圖1可見(jiàn)，以醋酸為流動(dòng)相時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)樣色譜圖不理想。
[0051]后選用0.05mol/LNaH2P04-0.05mol/L Na2HPO4 (pH = 6.8)以及庚烷磺酸鈉離子對(duì)5mM做流動(dòng)相，結(jié)果如圖2。
[0052]從圖2可見(jiàn)，標(biāo)準(zhǔn)樣基線平直，能很好地顯示出2個(gè)峰來(lái)，色譜圖比較理想。
[0053]為了確定流動(dòng)相是否對(duì)圖2的標(biāo)準(zhǔn)樣中的峰有干擾，對(duì)磷酸流動(dòng)相進(jìn)行液相色譜分析，結(jié)果如圖3。
[0054]從圖3可見(jiàn)，磷酸流動(dòng)相對(duì)液相色譜的干擾相當(dāng)小，圖2中標(biāo)準(zhǔn)樣中的2個(gè)峰，應(yīng)不是磷酸流動(dòng)相干擾造成。
[0055]因?yàn)楹与喽舅貥?biāo)準(zhǔn)樣用0.2%醋酸溶解，所以對(duì)0.2%醋酸進(jìn)行色譜分析，結(jié)果如圖4。
[0056]從圖4可見(jiàn)，除2.30之間有一個(gè)峰之外，其它位置基線平直，不會(huì)對(duì)溶解物造成干擾。這也說(shuō)明，以磷酸為流動(dòng)相能較好地將醋酸溶解的河豚毒素分離出來(lái)(圖2)。
[0057]檢測(cè)波長(zhǎng)的確定
[0058]以流動(dòng)相作為標(biāo)準(zhǔn)液，對(duì)流動(dòng)相溶液進(jìn)行全波段掃描，結(jié)果如圖5。
[0059]從圖5可見(jiàn)，磷酸緩沖液流動(dòng)相在紫外分光光度計(jì)下幾乎沒(méi)有吸收峰，不會(huì)對(duì)液相色譜結(jié)果產(chǎn)生干擾。
[0060]因?yàn)楹与喽舅赜?.2%的醋酸溶液溶解，中國(guó)鱟和圓尾鱟組織均用稀醋酸溶液提抽，所以，對(duì)0.2%的醋酸溶液溶解進(jìn)行全波段掃描，結(jié)果見(jiàn)圖6。
[0061]從圖6可見(jiàn)，0.2%醋酸最大吸收峰值為210.0Onm。
[0062]因?yàn)楹与喽舅貥?biāo)準(zhǔn)樣用0.2%醋酸溶解，所以，再對(duì)河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波段掃描，結(jié)果見(jiàn)圖7。
[0063]從圖7可見(jiàn)，0.2%醋酸溶解的河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)樣最大吸收峰值為208.0Onm。
[0064]再以中國(guó)鱟和圓尾鱟的肌肉樣品溶液為代表，對(duì)抽提的樣品進(jìn)行全波段掃描，結(jié)果見(jiàn)圖8、9。
[0065]從圖8可見(jiàn)，中國(guó)鱟肌肉抽提樣最大吸收峰值為230.0Onm。從圖9可見(jiàn)，圓尾鱟肌肉抽提樣最大吸收峰值為212.0Onm。
[0066]綜合分析醋酸、河豚毒素及中國(guó)鱟和圓尾鱟樣品的紫外吸收峰可知，194-214nm應(yīng)是檢測(cè)河豚毒素的理想波長(zhǎng)區(qū)間。所以，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品分別選用194、198、200、204、214nm等5種波長(zhǎng)進(jìn)行色譜檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖10。
[0067]從圖10可見(jiàn)，198nm(圖1Ob)和200nm(圖10c)TTX的吸收峰最高，而且兩者相差不大。這說(shuō)明198nm、200nm紫外波長(zhǎng)檢測(cè)河豚毒素較為理想。200nm被選定為本實(shí)驗(yàn)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。
[0068]河豚毒素峰位置的確定
[0069]確定流動(dòng)相和檢測(cè)波長(zhǎng)后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣河豚毒素的峰位置確定。在磷酸流動(dòng)相、200nm紫外波長(zhǎng)條件下，進(jìn)行0.2%醋酸和河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)樣的色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖11。
[0070]從圖11可見(jiàn)，在a的0.2%醋酸色譜圖中，只在2.3.0位置有一吸收峰；而b的0.2%醋酸溶解的河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)樣的色譜圖中，除在2.30位置有一吸收峰外，在8.3附近有另一明顯的吸收峰。這說(shuō)明，圖2標(biāo)準(zhǔn)樣色譜圖中的第一個(gè)峰應(yīng)是溶劑醋酸，第二個(gè)峰是河豚毒素。
[0071]中國(guó)鱟與圓尾鱟河豚毒素的比較
[0072]中國(guó)鱟和圓尾鱟肌肉河豚毒素的比較
[0073]將河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)樣、中國(guó)鱟肌肉、圓尾鱟肌肉色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果如圖12。
[0074]從圖12可見(jiàn)，在8.5附近，圓尾鱟肌肉(圖12c)與河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)樣(圖12a)有一明顯的吸收峰，而中國(guó)鱟肌肉(圖12b)這一峰不明顯。這說(shuō)明，圓尾鱟肌肉里含有河豚毒素，而中國(guó)鱟肌肉里幾乎不含河豚毒素。
[0075]中國(guó)鱟和圓尾鱟黃色結(jié)締組織河豚毒素的比較
[0076]將河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)樣、中國(guó)鱟黃色結(jié)締組織、圓尾鱟黃色結(jié)締組織色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果如圖13。
[0077]從圖13可見(jiàn)，在8.5附近，圓尾鱟黃色結(jié)締組織(圖13c)與河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)樣(圖13a)有一明顯的吸收峰，而中國(guó)鱟黃色結(jié)締組織(圖13b)這一峰不明顯。這說(shuō)明，圓尾鱟黃色結(jié)締組織里含有河豚毒素，而中國(guó)鱟黃色結(jié)締組織里幾乎不含河豚毒素。
[0078]比較中國(guó)鱟與圓尾鱟體內(nèi)河豚毒素量的大小
[0079]將河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)樣、中國(guó)鱟肌肉、圓尾鱟肌肉色譜圖色譜峰的高矮進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖14。
[0080]從圖14可見(jiàn)，在8.5附近，圓尾鱟肌肉的吸收峰(圖14c)最高，標(biāo)準(zhǔn)樣的吸收峰(圖14a)其次，而中國(guó)鱟肌肉(圖14b)在這一點(diǎn)的吸收峰不明顯。這說(shuō)明，圓尾鱟肌肉里含有河豚毒素多，而中國(guó)鱟肌肉里幾乎不含河豚毒素。
[0081]將河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)樣、中國(guó)鱟黃色結(jié)締組織、圓尾鱟黃色結(jié)締組織色譜圖進(jìn)行色譜峰高矮的比較，結(jié)果如圖15。
[0082]從圖15可見(jiàn)，在8.5附近，圓尾鱟黃色結(jié)締組織的吸收峰(圖15c)最高，標(biāo)準(zhǔn)樣的吸收峰(圖15a)其次，而中國(guó)黃色結(jié)締組織(圖15b)在這一點(diǎn)的吸收峰不明顯。這說(shuō)明，圓尾鱟黃色結(jié)締組織里含有河豚毒素多，而中國(guó)鱟黃色結(jié)締組織里幾乎不含河豚毒素。
[0083]以上所述，僅為本發(fā)明最佳實(shí)施方式，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見(jiàn)地得到的技術(shù)方案的簡(jiǎn)單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種中國(guó)鱟和圓尾鱟體內(nèi)的河豚毒素的檢測(cè)方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制 精密稱量TTX 1.0mg置于5ml離心管中，用Iml移液槍吸取1.0mL的濃度為0.2%醋酸，使其溶解后即得1.0mg/mL的TTX貯備溶液，置于冰箱中保存； (2)樣品的前處理 取中國(guó)鱟或圓尾鱟待測(cè)組織10g，剪碎后加1ml pH = 3.5濃度為0.1 %的醋酸于玻璃勻漿器中勻漿，充分勻漿后將樣品置于燒瓶中，加50ml濃度為0.1 %的醋酸，然后在水浴鍋中沸水浴10-20分鐘，邊加熱邊攪拌，轉(zhuǎn)速控制在150-200r/min，冷卻后用0.45 μ m濾膜真空抽濾，將濾液放入蒸發(fā)皿中，在60-70°C的水浴鍋上進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，直至10ml，然后過(guò)濾定溶至10ml，將濃縮的濾液1ml放在離心管中，經(jīng)10000r/min的速度，離心15分鐘，取上清液經(jīng)0.22 μπι的微孔濾膜過(guò)濾后，放入干凈的離心管中，作為液相色譜待測(cè)液； (3)液相色譜測(cè)試 醋酸流動(dòng)相色譜條件固定相:SunFire?C18色譜柱，直徑4.6mmX長(zhǎng)度150mm，進(jìn)樣量為20 μ ;流動(dòng)相:0.2%醋酸；流速:0.8mL/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):21nm ;柱溫:25°C ;每次進(jìn)樣體積為60 μ L ;pH為3.0 ; 磷酸流動(dòng)相色譜條件固定相:SunFire?C18色譜柱，尺寸為4.6mmX 150mm,進(jìn)樣量為.20 μ I ;流動(dòng)相:0.05mol/L NaH2PO4-0.05mol/L Na2HPO4, pH = 6.8，庚烷磺酸鈉離子對(duì) 5mM ；流速:lmL/min ;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為200nm ;柱溫:25°C ;每次進(jìn)樣體積為60 μ L ；ρΗ為6.8。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種中國(guó)鱟和圓尾鱟體內(nèi)的河豚毒素的方法，包括以下步驟：(1)標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制；(2)樣品的前處理；(3)液相色譜測(cè)試。本發(fā)明采用高效液相色譜法檢測(cè)中國(guó)鱟和圓尾鱟體內(nèi)的河豚毒素，以便證明鱟體內(nèi)的毒素到底是不是含有河豚毒素，從而知道是食什么鱟引起食鱟中毒以及含量多少，為食鱟中毒的預(yù)防和治療提供參考。
【IPC分類】G01N30-02
【公開號(hào)】CN104820033
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510220110
【發(fā)明人】廖永巖
【申請(qǐng)人】欽州學(xué)院
【公開日】2015年8月5日
【申請(qǐng)日】2015年5月4日