金黃色葡萄球菌膠體金檢測試紙卡及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物醫(yī)學(xué)免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種檢測金黃色葡萄球菌的膠體金試紙卡及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S.aureus)是一種最為常見的革蘭氏陽性致病菌，在自然界中廣泛分布，具有很強的致病作用和致死率。S.aureus感染在畜牧業(yè)中流行嚴(yán)重，給畜牧業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟損失，尤其在奶牛乳房炎方面，該菌是主要的致病菌之一。近年來，美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。因此，對金黃色葡萄球菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷可以及時采取治療和控制措施，減少不必要的經(jīng)濟損失。
[0003]免疫層析膠體金技術(shù)是適應(yīng)我國現(xiàn)代養(yǎng)殖模式的畜禽疫病快速檢測的最佳選擇。ELISA技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)這類適合實驗室、醫(yī)院、大型養(yǎng)殖場的檢測方法對廣大農(nóng)民來說并不合適，起碼在短期內(nèi)這些技術(shù)離我國廣大農(nóng)民比較遙遠(yuǎn)。農(nóng)村需要的是操作簡便，人人都能快速實施的檢測方法。如能開發(fā)檢測快速、靈敏度高、特異性強、使用簡便、價格低廉的膠體金試紙卡將具有十分重要的現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為解決上述技術(shù)問題的不足，提供一種金黃色葡萄球菌膠體金檢測試紙卡及其制備方法和應(yīng)用，可以臨床快速檢測畜禽、奶牛養(yǎng)殖場及食品業(yè)中的金黃色葡萄球菌，用于該菌的臨床診斷。
[0005]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題的不足，所采用的技術(shù)方案是:
[0006]1、金黃色葡萄球菌膠體金檢測試紙卡，其特征在于:所述金黃色葡萄球菌膠體金檢測試紙卡由膠體金試紙條和扣板式卡槽組成；扣板式卡槽具有一個容置膠體金試紙條的內(nèi)置空腔，且扣板式卡槽上設(shè)置有觀察區(qū)和加樣區(qū)；膠體金試紙條主要由支持板、NC膜(硝酸纖維素膜)、金標(biāo)抗體墊、樣品墊和吸收墊組成；
[0007]所述的NC膜設(shè)置在支持板的中部，NC膜一側(cè)的支持板上依次粘貼有金標(biāo)抗體墊和樣品墊，NC膜另一側(cè)的支持板上粘貼有吸收墊；所述NC膜的中部有一條含有金黃色葡萄球菌多克隆抗體的檢測線和一條含有羊抗鼠二抗的質(zhì)控線；膠體金試紙條設(shè)置在卡槽的內(nèi)置空腔內(nèi)，卡槽的觀察區(qū)對應(yīng)膠體金試紙條的顯色區(qū)，加樣孔對應(yīng)膠體金試紙條的樣品墊；
[0008]所述樣品墊中金標(biāo)抗體為兔抗金黃色葡萄球菌isdB蛋白單克隆抗體；
[0009]所述NC膜中金黃色葡萄球菌抗體為兔源金黃色葡萄球菌isdB蛋白多克隆抗體；所述NC膜中羊抗鼠二抗為羊抗鼠IgG抗體。
[0010]2、上述的金黃色葡萄球菌膠體金檢測試紙卡的制備方法，其特征在于:包括以下步驟:
[0011](I)制備 NC 膜
[0012]兔源金黃色葡萄球菌isdB蛋白多克隆抗體的制備:采用原核表達(dá)并純化的金黃色葡萄球菌isdB蛋白作為免疫原，提取IgG抗體，制備兔源金黃色葡萄球菌isdB蛋白多克隆抗體；
[0013]檢測線的制備:采用三維噴膜儀，調(diào)整噴液量為53?55dotS/mL/cm，用包被緩沖液稀釋兔源金黃色葡萄球菌isdB蛋白多克隆抗體，濃度為60?65 μ g/ml，在NC膜中檢測線位置劃線，即為檢測線，晾干備用；所述的包被緩沖液為經(jīng)過0.40?0.45 μ I濾膜過濾的0.05Μ、ρΗ9.6的CBS緩沖液(碳酸鹽緩沖液)；
[0014]質(zhì)控線的制備:采用三維噴膜儀，調(diào)整噴液量為50?55dotS/mL/cm，用包被緩沖液稀釋羊抗鼠IgG抗體，濃度為1.6mg/ml，在NC膜上與檢測線平行的位置劃線，間隔5mm，即為質(zhì)控線，所述的包被緩沖液為經(jīng)過0.40?0.45 μ I濾膜過濾的0.03Μ、ρΗ9.4的CBS緩沖液；
[0015]NC膜組裝制備:晾干檢測線和質(zhì)控線，得到含有檢測線和質(zhì)控線的NC膜；用封閉工作液將制備的NC膜于室溫72h晾干，封存?zhèn)溆?；所述的封閉工作液為2.5?2.8% BSA、2.2?2.6%脫脂奶粉和0.01Μ、ρΗ7.0的CBS緩沖液混合后用0.42?0.45 μ I濾膜過濾得到的封閉工作液；
[0016](2)制備涂覆金標(biāo)抗體墊
[0017]用20mM含質(zhì)量百分比為1.5% BSA,0.1 % NaNjP 3 %四硼酸鈉的稀釋緩沖液(水溶液)，將金標(biāo)鼠源金黃色葡萄球菌單克隆抗體稀釋至終濃度0.08mg/mL ;裁取規(guī)格為300X7mm的玻璃纖維棉，將金標(biāo)抗體溶液用單向噴點儀，以6 μ L/cm的速度(大約22ng/條)，均勻噴灑于玻璃纖維棉，56°C干燥lh，加入干燥劑真空密封后，室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0018](3)組裝金黃色葡萄球菌膠體金檢測試紙卡
[0019]將涂有檢測線和質(zhì)控線的NC膜粘貼在支持板的中部，在NC膜的一側(cè)依次粘貼含有金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜和樣品墊，在NC膜的另一側(cè)粘貼吸收墊，得到試紙板，將試紙板切割成不同寬度的試紙條，將試紙條安放于卡槽中即為金黃色葡萄球菌膠體金檢測試紙卡。
[0020](4)金黃色葡萄球菌膠體金檢測試紙卡使用及判定
[0021]金黃色葡萄球菌膠體金檢測試紙卡在診斷畜禽、奶牛養(yǎng)殖場臨床樣本或食品中的金黃色葡萄球菌中應(yīng)用，將增菌后的培養(yǎng)液50 μ I加至1.5mlEP管中，加入200 μ I滅菌水混勻即得待檢樣品，將所得的待檢樣品100 μ I滴加在本試紙卡的載樣墊中，在試紙卡的檢測線、質(zhì)控線位置均出現(xiàn)紅色條帶時，金黃色葡萄球菌檢測為陽性；僅質(zhì)控線出現(xiàn)一條紅色條帶時，為陰性結(jié)果；在試紙卡的質(zhì)控線未出現(xiàn)紅色條帶時為無效結(jié)果。
[0022]其中，步驟(I)中檢測線和質(zhì)控線的線寬為1mm，兩線相距4mm，位于膜的中間，距NC膜的邊距6?7_。
[0023]有益效果:
[0024]本發(fā)明所述的膠體金試紙卡利用人工合成金黃色葡萄球菌的主要抗原表位isdB蛋白，制備特性新高、敏感性好的鼠源金黃色葡萄球菌單克隆抗體。通過工藝成熟的膠體金免疫層析技術(shù)，通過試紙卡中纖維素膜上分別噴涂含金黃色葡萄球菌多克隆抗體的檢測線和含羊抗鼠IgG抗體的質(zhì)控線，能夠臨床檢測金黃色葡萄球菌，為畜禽、奶牛養(yǎng)殖場及食品業(yè)等提供一種臨床診斷金黃色葡萄球菌的試紙卡，該試紙卡具有特異性強、靈敏度高、檢測快速的優(yōu)點，且不需要使用儀器設(shè)備，成本低廉，操作方便，能廣泛應(yīng)用于畜禽、奶牛養(yǎng)殖場及食品業(yè)對金黃色葡萄球菌的快速、準(zhǔn)確診斷，減少重大經(jīng)濟損失。
【附圖說明】
[0025]圖1是本發(fā)明的膠體金試紙卡的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0026]圖中:1、扣板式卡槽2、支持板，3、加樣孔4、樣品墊5、金標(biāo)抗體墊6、NC膜7、觀察區(qū)8、吸收墊
【具體實施方式】
[0027]實施例1
[0028]—種金黃色葡萄球菌膠體金檢測試紙卡，其由膠體金試紙條和扣板式卡槽組成；扣板式卡槽具有一個容置膠體金試紙條的內(nèi)置空腔，且扣板式卡槽上設(shè)置有觀察區(qū)和加樣區(qū)；膠體金試紙條主要由支持板、NC膜、金標(biāo)抗體墊、樣品墊和吸收墊組成；
[0029]所述的NC膜設(shè)置在支持板的中部，NC膜一側(cè)的支持板上依次粘貼有金標(biāo)抗體墊和樣品墊，NC膜另一側(cè)的支持板上粘貼有吸收墊；所述NC膜的中部有一條含有金黃色葡萄球菌多克隆抗體的檢測線和一條含有羊抗鼠二抗的質(zhì)控線；膠體金試紙條設(shè)置在卡槽的內(nèi)置空腔內(nèi)，卡槽的觀察區(qū)對應(yīng)膠體金試紙條的顯色區(qū)，加樣孔對應(yīng)膠體金試紙條的樣品墊；
[0030]所述樣品墊中金標(biāo)抗體為兔抗金黃色葡萄球菌isdB蛋白單克隆抗體；
[0031]所述NC膜中金黃色葡萄球菌抗體為兔源金黃色葡萄球菌isdB蛋白多克隆抗體；所述NC膜中羊抗鼠二抗為羊抗鼠IgG抗體。
[0032]實施例2
[0033]金黃色葡萄球菌膠體金檢測試紙卡的制備方法，其包括以下步驟:
[0034](I)制備 NC 膜
[0035]兔源金黃色葡萄球菌isdB蛋白多克隆抗體的制備:采用原核表達(dá)并純化的金黃色葡萄球菌isdB蛋白作為免疫原，提取IgG抗體，制備兔