一種免疫磁珠及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫磁珠技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種表面基團(tuán)為羧基的免疫磁珠及其制 備方法和其在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 食源性致病菌檢測(cè)免疫磁珠制備技術(shù)是將檢測(cè)用抗體分子固定在磁性粒子表面， 在外加磁場(chǎng)作用下，利用特異性識(shí)別結(jié)合作用將免疫磁珠以及捕獲到的致病菌富集分離的 技術(shù)。這一檢測(cè)方法靈敏度高，且具有操作簡(jiǎn)單便捷的優(yōu)勢(shì)。
[0003] 在食源性致病菌檢測(cè)分離用免疫磁珠中，采用羧基固定抗體分子的免疫磁珠應(yīng)用 較廣。這類(lèi)免疫磁珠多是將羧基材料(如聚丙烯酸）包裹在磁珠表面，利用免疫磁珠表面 存在的大量自由羧基與多肽或者抗體結(jié)構(gòu)中氨基反應(yīng)，將抗體或者多肽固定在免疫磁珠表 面。這種免疫磁珠表面大量自由羧基的存在利于提高抗體固定效率。但是也存在弊端，由 于電荷屏蔽作用降低了粒子間斥力，單純的聚丙烯酸包被的免疫磁珠在檢測(cè)液體中粒度穩(wěn) 定性下降，易于發(fā)生粒子間團(tuán)聚導(dǎo)致沉淀失去檢測(cè)能力。
[0004] 為保證上述免疫磁珠粒度穩(wěn)定性，免疫磁珠的表面自由羧基量受到一定限制。然 而，羧基數(shù)量以及由之決定的抗體分子的固定量直接決定免疫分離識(shí)別效率。因此，在基于 羧基磁珠的分離體系中，設(shè)法平衡磁珠粒度穩(wěn)定性以及羧基數(shù)量相關(guān)的免疫分離效果極為 重要。尋求一種制備簡(jiǎn)單的表面富含羧基并能維持檢測(cè)緩沖液環(huán)境下粒度穩(wěn)定性的羧基化 磁珠成為目前免疫磁珠研究領(lǐng)域面臨的難題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種免疫磁珠及其制備方法和應(yīng)用，所述免疫 磁珠為羧基磁珠，其表面富含羧基，抗體固定效率高；并且所述免疫磁珠在檢測(cè)緩沖液環(huán)境 下粒度穩(wěn)定性高。
[0006] 在第一方面，本發(fā)明提供一種免疫磁珠，包括磁性粒子內(nèi)核和包被在所述磁性粒 子內(nèi)核外表面的羧基糖類(lèi)，其中所述磁性粒子包括超順磁性四氧化三鐵。
[0007] 本發(fā)明的免疫磁珠中，超順磁性四氧化三鐵為免疫磁珠提供磁分離所需要的磁 性，除此之外還可能在不影響磁性的情況下包含三氧化二鐵或雜質(zhì)成分。
[0008] 本發(fā)明的免疫磁珠中，羧基糖類(lèi)分子中眾多羥基的水合性能保證磁珠的水力學(xué)尺 寸穩(wěn)定性，能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定地分散在電解質(zhì)溶液中，而不發(fā)生沉淀或團(tuán)聚現(xiàn)象，例如本發(fā)明的 尺寸為30nm的羧基葡聚糖免疫磁珠在磷酸緩沖液中能夠維持長(zhǎng)期（24小時(shí)以上)穩(wěn)定而不 沉淀，而相同條件下尺寸相當(dāng)?shù)木郾┧崦庖叽胖樵诹姿峋彌_液中靜置2小時(shí)就會(huì)完全沉 淀至容器底部；同時(shí)糖類(lèi)分子中部分羥基轉(zhuǎn)化為羧基，利于抗體或多肽的高效固定。
[0009] 本發(fā)明的免疫磁珠中，糖類(lèi)的作用在于一方面提供大量的羥基，其水合性能保證 磁珠的水力學(xué)尺寸穩(wěn)定性；另一方面部分羥基轉(zhuǎn)化為羧基提供抗體或多肽固定所需要的位 點(diǎn)。因此本發(fā)明中糖類(lèi)的具體種類(lèi)可以不做限定，只要具有大量羥基，并且部分羥基能夠轉(zhuǎn) 化為羧基即可。
[0010] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述糖類(lèi)選自葡萄糖、果糖、葡聚糖、蔗糖和麥芽糖 中的1種或至少2種的組合，所述組合典型并非限定性的實(shí)例比如葡萄糖和果糖的組合，葡 萄糖和葡聚糖的組合，葡萄糖和蔗糖的組合，果糖和葡聚糖的組合，果糖和蔗糖的組合，果 糖和麥芽糖的組合，蔗糖和麥芽糖的組合，葡萄糖、果糖和葡聚糖的組合，果糖、葡聚糖和蔗 糖的組合，葡聚糖、蔗糖和麥芽糖的組合，等等；優(yōu)選葡萄糖、果糖和葡聚糖中的1種或至少 2種的組合。
[0011] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述免疫磁珠的粒徑介于20nm-3 μ m范圍內(nèi)，例 如 30nm、50nm、100nm、200nm、300nm、500nm、700nm、900nm、1. 2 μ m、1. 5 μ m、1. 8 μ m、2. 1 μ m、 2· 4 μ m、2. 7 μ m、2. 8 μ m、2. 9 μ m、50nm-800nm或 200nm_l· 5 μ m，優(yōu)選 lOOnm-l μ m范圍內(nèi)。免 疫磁珠的粒徑過(guò)大會(huì)造成沉淀或團(tuán)聚現(xiàn)象的發(fā)生，分散性能差；免疫磁珠的粒徑過(guò)小往往 導(dǎo)致與抗體或多肽結(jié)合的困難，可能由于空間位阻效應(yīng)。
[0012] 在第二方面，本發(fā)明提供一種制備第一方面所述的免疫磁珠的方法，包括如下步 驟：
[0013] (1)磁珠的制備：使三價(jià)鐵源、二價(jià)鐵源和糖類(lèi)在堿性溶液作用下共沉淀生成包含 順磁性四氧化三鐵的磁性粒子，所述磁性粒子表面包被有糖類(lèi)分子；
[0014] (2)磁珠的羧基化：用多元酸酐與磁性粒子表面的糖類(lèi)分子反應(yīng)生成羧基糖類(lèi)包 被的免疫磁珠。
[0015] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述三價(jià)鐵源與糖類(lèi)的質(zhì)量比為0. 1:1~6:1，例如 0· 1:1、0· 2:1、0· 5:1、0· 8:1、1:1、1· 2:1、1· 5:1、2:1、3:1、4:1、5:1 或 5. 8:1，優(yōu)選為 1:1 ~ 4:1。如果三價(jià)鐵源過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致形成的磁性粒子不能被糖類(lèi)充分包被，在免疫反應(yīng)過(guò)程中 可能會(huì)有不希望發(fā)生的非特異性結(jié)合；如果糖類(lèi)過(guò)多可能會(huì)影響共沉淀反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致 不能形成良好的磁性粒子，并且也是不必要的浪費(fèi)。
[0016] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述磁珠的制備在溫度為60~95°C下進(jìn)行，例如 在溫度為 62°〇、641：、671：、691：、711：、751：、781：、821：、881：、921：或941：下進(jìn)行，優(yōu)選為 80~90°C下進(jìn)行。
[0017] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述共沉淀的反應(yīng)時(shí)間為15分鐘~1小時(shí)，例如16 分鐘、18分鐘、20分鐘、25分鐘、28分鐘、32分鐘、36分鐘、40分鐘、45分鐘、48分鐘、52分 鐘、55分鐘或58分鐘，優(yōu)選為30分鐘~45分鐘。
[0018] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述共沉淀反應(yīng)在惰性氣體保護(hù)下進(jìn)行，所述惰性 氣體包括但不限于氮?dú)狻⒑?、氖氣和氬氣中?種或至少2種的組合。
[0019] 本發(fā)明中，所述三價(jià)鐵源的作用在于提供反應(yīng)所需要的三價(jià)鐵離子，因此對(duì)于三 價(jià)鐵源的種類(lèi)不做限定，可以是任何能夠提供三價(jià)鐵離子的含鐵化合物。作為本發(fā)明的優(yōu) 選技術(shù)方案，所述三價(jià)鐵源選自氯化鐵、硝酸鐵和硫酸鐵中的1種或至少2種的組合；所述 組合典型并非限定性的實(shí)例比如氯化鐵和硝酸鐵的組合，氯化鐵和硫酸鐵的組合，硝酸鐵 和硫酸鐵的組合，氯化鐵、硝酸鐵和硫酸鐵的組合。
[0020] 本發(fā)明中，所述二價(jià)鐵源的作用在于提供反應(yīng)所需要的亞鐵離子，因此對(duì)于二價(jià) 鐵源的種類(lèi)不做限定，可以是任何能夠提供亞鐵離子的含鐵化合物。作為本發(fā)明的優(yōu)選技 術(shù)方案，所述二價(jià)鐵源選自氯化亞鐵、硝酸亞鐵和硫酸亞鐵中的1種或至少2種的組合；所 述組合典型并非限定性的實(shí)例比如氯化亞鐵和硝酸亞鐵的組合，氯化亞鐵和硫酸的組合， 硝酸亞鐵和硫酸的組合，氯化亞鐵、硝酸亞鐵和硫酸的組合。
[0021] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述糖類(lèi)選自葡萄糖、果糖、葡聚糖、蔗糖和麥芽糖 中的1種或至少2種的組合，所述組合典型并非限定性的實(shí)例比如葡萄糖和果糖的組合，葡 萄糖和葡聚糖的組合，葡萄糖和蔗糖的組合，果糖和葡聚糖的組合，果糖和蔗糖的組合，果 糖和麥芽糖的組合，蔗糖和麥芽糖的組合，葡萄糖、果糖和葡聚糖的組合，果糖、葡聚糖和蔗 糖的組合，葡聚糖、蔗糖和麥芽糖的組合，等等；優(yōu)選葡萄糖、果糖和葡聚糖中的1種或至少 2種的組合。
[0022] 本發(fā)明中，所述堿性溶液的作用在于為共沉淀反應(yīng)提供堿性環(huán)境，因此對(duì)于堿性 溶液的具體選擇可以不做限定。作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述堿性溶液選自氨水、氫氧 化鈉和氫氧化鉀溶液中的1種或至少2種的組合；所述組合典型并非限定性的實(shí)例比如氨 水和氫氧化鉀溶液