的組合，氨水和氫氧化鈉溶液的組合，氫氧化鈉和氫氧化鉀溶液的組合， 氨水、氫氧化鈉和氫氧化鉀溶液的組合。如果用氨水作為堿性溶液，所述氨水占反應(yīng)液總重 量的25-75%能夠取得比較好的效果；如果用氫氧化鈉和/或氫氧化鉀溶液作為堿性溶液， 所述氫氧化鈉和/或氫氧化鉀占反應(yīng)液總重量的〇. 5-5%能夠取得比較好的效果。
[0023] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述步驟（1)生成的磁性粒子的粒徑介于 20ηηι-3μηι 范圍內(nèi)，例如 30nm、50nm、100nm、200nm、300nm、500nm、700nm、900nm、1.2ym、 1. 5 μ m> 1. 8 μ m>2. 1 μ m>2. 4 μ m>2. 7 μ m>2. 8 μ m>2. 9 μ m>50nm-800nm 5? 200nm-l. 5 μ m, it 選IOOnm-I μ m范圍內(nèi)。免疫磁珠的粒徑過大會造成沉淀或團(tuán)聚現(xiàn)象的發(fā)生，分散性能差； 免疫磁珠的粒徑過小往往導(dǎo)致與抗體或多肽結(jié)合的困難，可能由于空間位阻效應(yīng)。
[0024] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述多元酸酐選自戊二酸酐、馬來酸酐和丁二酸酐 中的1種或至少2種的組合，所述組合典型并非限定性的實例比如戊二酸酐和丁二酸酐的 組合，戊二酸酐和馬來酸酐的組合，馬來酸酐和丁二酸酐的組合，戊二酸酐、馬來酸酐和丁 二酸酐的組合，優(yōu)選丁二酸酐。
[0025] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述多元酸酐的用量按質(zhì)量計為所述磁性粒子用量 的1~5倍，比如I. 1倍、1. 2倍、1. 3倍、1. 5倍、1. 7倍、1. 9倍、2. 1倍、2. 5倍、3倍、3. 5倍、 4倍、4. 2倍、4. 5倍、4. 7倍、4. 8倍或4. 9倍。如果多元酸酐的用量偏少，會導(dǎo)致羧基化不充 分，提供給抗體或多肽結(jié)合的羧基位點偏少，影響固定效率；如果多元酸酐的用量偏多，會 導(dǎo)致羧基化過量，雖然提供給抗體或多肽結(jié)合的羧基位點多，但是其水合性能會受到影響， 導(dǎo)致磁珠的水力學(xué)尺寸穩(wěn)定性降低。
[0026] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述方法包括如下步驟：
[0027] (1)在惰性氣體保護(hù)下，將以鐵計濃度為1~10mg/mL的三價鐵源和二價鐵源的混 合溶液與以糖分子計濃度為2~40mg/mL的糖類溶液混合，并升溫到60~95°C ;
[0028] (2)加入堿性溶液，在惰性氣體保護(hù)下反應(yīng)15分鐘~1小時，生成包含順磁性四氧 化三鐵的磁性粒子；
[0029] (3)將所述磁性粒子磁分離并清洗后，分散于水中制成分散液；
[0030] (4)向所述分散液中加入相當(dāng)于所述磁性粒子質(zhì)量1~5倍的多元酸酐，反應(yīng)3~ 24小時得到羧基糖類包被的免疫磁珠。
[0031] 其中，步驟（3)中清洗可以使用蒸餾水、去離子水或雙蒸水等多次進(jìn)行，比如重復(fù) 清洗3~5次；步驟（4)反應(yīng)完成后，可以反復(fù)清洗3~5次后得到較純的免疫磁珠。
[0032] 上述方法獲得的羧基磁珠分散在超純水中，通過碳二亞胺和琥珀酰亞胺活化羧基 后可以與抗體或多肽連接，用于食源性致病菌檢測。
[0033] 在第三方面，本發(fā)明提供第一方面所述的免疫磁珠在食源性致病菌檢測中的應(yīng) 用。
[0034] 具體地，可以將檢測用抗體和/或多肽分子固定在所述免疫磁珠表面用于食源性 致病菌檢測。
[0035] 所述食源性致病菌包括但不限于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、志賀氏菌 和大腸桿菌0157。
[0036] 本發(fā)明的有益效果為：
[0037] 本發(fā)明的免疫磁珠，通過將包被到磁性粒子表面的糖類分子的部分羥基轉(zhuǎn)化為羧 基，利于抗體或多肽的高效固定；同時羧基糖類分子中眾多羥基的水合性能保證磁珠的水 力學(xué)尺寸穩(wěn)定性，能夠長期穩(wěn)定地分散在電解質(zhì)溶液中，而不發(fā)生沉淀或團(tuán)聚現(xiàn)象。
【附圖說明】
[0038] 圖1為本發(fā)明實施例1制備的羧基葡聚糖磁珠磁分離前后對照圖，其中左圖為磁 分離前的情況，羧基葡聚糖磁珠均勻分散在溶液中，穩(wěn)定性好，沒有沉淀或團(tuán)聚現(xiàn)象；右圖 為磁分離后的情況，羧基葡聚糖磁珠在磁鐵施加的磁場作用下貼壁，溶液呈澄清透明，可見 羧基葡聚糖磁珠的磁性良好。
[0039] 圖2為本發(fā)明實施例1制備的羧基葡聚糖磁珠的紅外傅里葉變換光譜圖，其中曲 線A為葡聚糖的紅外傅里葉變換光譜曲線，曲線B為葡聚糖磁珠的紅外傅里葉變換光譜曲 線，曲線C為羧基葡聚糖磁珠的紅外傅里葉變換光譜曲線。
[0040] 圖3為本發(fā)明實施例1制備的羧基葡聚糖磁珠固定沙門氏菌抗體的捕獲效率與目 前市場上的Dynal磁珠的捕獲效率的對比結(jié)果。
【具體實施方式】
[0041] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理 解，以下實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本 發(fā)明的范圍。
[0042] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的實驗材料，如無 特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購買得到的。
[0043] 實施例1
[0044] 稱取 FeCl3 WH2CBSOn^FeSO4 ·7Η20300π^，超純水溶制成有 40mL 溶液，再稱取 L Og 葡聚糖T7 (分子量7000)，加水制成50mL溶液。取250mL三口圓底燒瓶，一斜口通氮?dú)?，?一斜口排出空氣，直口中插入機(jī)械攪拌器的攪拌棒。將鐵鹽溶液和糖類溶液依次從斜口倒 入三口燒瓶中，再量取50mL氨水，從斜口倒入三口燒瓶中，溶液立即變成烏黑色。將三口 燒瓶放在水浴鍋中，調(diào)整溫度至80°C，調(diào)整轉(zhuǎn)速為lOOOrpm，持續(xù)通氮?dú)猓磻?yīng)35分鐘。反 應(yīng)完成后，溶液呈烏黑色，無明顯大塊沉淀。反復(fù)磁分離水洗重復(fù)三次后，重新分散于去離 子水中，得到葡聚糖包覆的四氧化三鐵磁珠。量取上述30mL葡聚糖包覆的磁珠液體(含四 氧化三鐵顆粒IOOmg)溶液加入到IOOmL的圓底單口燒瓶中。稱取450mg 丁二酸酐溶于裝 有20mL溶劑二甲基甲酰胺（DMF)的離心管中，將溶液倒入單口燒瓶中，通氮?dú)馀趴諝?，加蓋 子封口，放于40°C磁力攪拌油浴鍋中，持續(xù)攪拌反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，將磁珠產(chǎn)物磁分離 水洗分離三次后保存在無菌磷酸緩沖液中待用。本實施例制備的磁珠尺寸在200-300nm之 間，具有超順磁性。
[0045] 實施例2
[0046] 稱取 FeCl3 · 6H20350mg，F(xiàn)eSO4 · 7H20300mg，超純水溶制成^ 40mL 溶液，再稱取 〇. 7g葡聚糖T7 (分子量7000)，加水制成50mL溶液。取250mL三口圓底燒瓶，一斜口通氮 氣，另一斜口排出空氣，直口中插入機(jī)械攪拌器的攪拌棒。將鐵鹽溶液和糖類溶液依次從斜 口倒入三口燒瓶中，再量取50mL氨水，從斜口倒入三口燒瓶中，溶液立即變成烏黑色。將 三口燒瓶放在水浴鍋中，調(diào)整溫度至80°C，調(diào)整轉(zhuǎn)速為500rpm，持續(xù)通氮?dú)?，反?yīng)35分鐘。 反應(yīng)完成后，溶液呈烏黑色。反復(fù)磁分離水洗重復(fù)三次后，重新分散于去離子水中，得到葡 聚糖包覆的四氧化三鐵磁珠。量取上述30mL葡聚糖包覆的磁珠液體(含四氧化三鐵顆粒 IOOmg)溶液加入到IOOmL的圓底單口燒瓶中。稱取450mg 丁二酸酐溶于裝有20mL溶劑DMF 的離心管中，將溶液倒入單口燒瓶中，通氮?dú)馀趴諝猓由w子封口，放于40°C磁力攪拌油浴 鍋中，持續(xù)攪拌反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，將磁珠產(chǎn)物磁分離水洗分離三次后保存在無菌磷酸 緩沖液中待用。本實施例制備的磁珠尺寸在300-500nm之間，具有超順磁性。
[0047] 實施例3
[0048] 稱取 FeCl