一種納米熒光傳感器及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物分析及生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)ATP的納米熒光傳感器及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]三磷酸腺苷(ATP)是廣泛存在于生物細(xì)胞內(nèi)的一種輔酶，由腺苷和三個(gè)磷酸基組成。作為細(xì)胞內(nèi)能量傳遞的“分子通貨”，ATP儲(chǔ)存和傳遞化學(xué)能，是體內(nèi)組織細(xì)胞所需能量的主要來(lái)源，參與蛋白質(zhì)、脂肪、糖和核苷酸的合成，對(duì)細(xì)胞許多代謝過程均有重要的調(diào)節(jié)作用，ATP的含量變化可以反映細(xì)胞的變異和損傷。因此，ATP作為重大疾病的標(biāo)志物之一得到了廣泛的研宄和關(guān)注。通過檢測(cè)惡性腫瘤ATP濃度變化，可以了解其細(xì)胞代謝情況，為惡性腫瘤藥敏的異質(zhì)性和個(gè)體化療提供可行性治療方案。因此，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的ATP分析方法不僅有助于癌癥等重大疾病的早期診斷及治療，同時(shí)對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、食品衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測(cè)、醫(yī)藥及化妝品等諸多領(lǐng)域也有著重要的實(shí)際意義。
[0003]目前，國(guó)內(nèi)外ATP的檢測(cè)方法除了作為主流技術(shù)的高效液相色譜法以外，其它還有電泳法、分光光度法和生物發(fā)光法等。這些方法在儀器設(shè)備、時(shí)間、靈敏度、準(zhǔn)確性等方面都或多或少地存在不足，尤其是靈敏度和選擇性尚待提高。為此，迫切需要開發(fā)高靈敏、高選擇性的檢測(cè)技術(shù)用于ATP的檢測(cè)。
[0004]近幾年來(lái)，金納米籠作為一種新興的納米材料得到了廣泛的關(guān)注。該納米材料是一種中空多孔的結(jié)構(gòu)，即籠狀顆粒的內(nèi)部為空心結(jié)構(gòu)，光滑的籠壁表面上分布著小孔。與傳統(tǒng)的球型金納米顆粒相比，金納米籠的局域表面等離子共振峰位于近紅外區(qū)700?900nm，該波段對(duì)于生物醫(yī)學(xué)意義重大，尤其是對(duì)于活體研宄。將金納米籠與核酸適體和金納米籠表面正電荷修飾技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)還未見文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，同時(shí)，也為了更加有效地利用具有特殊結(jié)構(gòu)的納米材料的顯著優(yōu)點(diǎn)，針對(duì)檢測(cè)ATP的納米熒光傳感器少有報(bào)道，因此，本發(fā)明的第一目的:構(gòu)建并制備一種新型的可用于檢測(cè)ATP的納米熒光傳感器，即將金納米籠與核酸適體和表面正電荷修飾技術(shù)結(jié)合在一起，使該納米焚光傳感器具有可生物響應(yīng)的分子門，一旦加入需要檢測(cè)的靶分子如ATP，則發(fā)生靶分子及其適體的特異性識(shí)別反應(yīng)，導(dǎo)致適體鏈從金納米籠表面脫離，使封堵籠孔的分子門被打開，并使孔內(nèi)被封堵的熒光分子被釋放出來(lái)，因此，利用該熒光傳感器，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)靶分子的高靈敏、高選擇性檢測(cè)，為癌癥等重大疾病的早期診斷、治療、理論研宄等提供新方法；本發(fā)明的第二目的:提供一種該納米熒光傳感器的制備方法；本發(fā)明的第三目的:提供一種應(yīng)用該納米熒光傳感器檢測(cè)ATP的方法。將本發(fā)明提出的納米熒光傳感器用于ATP的熒光檢測(cè)，能夠顯著地提高ATP檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的的。本發(fā)明的納米熒光傳感器是以金納米籠作為載體，利用其空心多孔的結(jié)構(gòu)特性，在其內(nèi)部裝載熒光分子，為了防止熒光分子的外泄，通過在其表面組裝核酸適體分子門，將金納米籠表面的孔封堵；其中，所述的核酸適體可以通過靜電作用被組裝到金納米籠表面，具體可以通過在金納米籠表面修飾正電荷的方法而將其組裝到金納米籠表面，優(yōu)選地采用聚二烯丙基二甲基氯化銨即roDA作為正電荷修飾劑在金納米籠表面修飾一層聚陽(yáng)離子。
[0007]優(yōu)選地，上述納米熒光傳感器，所述的熒光分子是羅丹明B。
[0008]一種制備上述納米熒光傳感器的制備方法，包括如下步驟:
[0009](I)在磁珠-金納米籠的復(fù)合物中加入I3DDA溶液，室溫振蕩過夜；
[0010](2)磁分離上述溶液后加入羅丹明B溶液，室溫振蕩過夜；
[0011](3)向上述溶液中加入核酸適體溶液，室溫振蕩過夜，磁分離，用PBS緩沖溶液清洗后即制得熒光傳感器；
[0012]其中，所述的磁珠-金納米籠的復(fù)合物按如下方法制備而成:將磁珠與金納米籠的混合溶液置于室溫振蕩反應(yīng)10h，磁分離，用PBS緩沖溶液清洗，移除上清夜，即得。
[0013]一種利用本發(fā)明的納米熒光傳感器用于ATP的檢測(cè)，方法如下:
[0014](I)將ATP樣品溶液加入到本發(fā)明的納米熒光傳感器的PBS懸浮液中，37°C恒溫振蕩反應(yīng)lh，發(fā)生靶分子ATP與其適體的特異性結(jié)合，使ATP適體從金納米籠表面脫離，分子門被打開；
[0015](2)磁分離上述溶液，收集上清液，檢測(cè)其熒光信號(hào)。
[0016]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提出的納米熒光傳感器將納米技術(shù)與適體分子生物門相結(jié)合，通過分子識(shí)別及特異性反應(yīng)，使適體分子門被打開，釋放出熒光分子，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的檢測(cè)，該方法使ATP的檢測(cè)靈敏度得到顯著提高，可實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP高靈敏、高選擇性的檢測(cè)。本發(fā)明的納米熒光傳感器具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，可控性強(qiáng)，熒光信號(hào)靈敏等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，不受其它常見干擾物質(zhì)影響，具有高的選擇性，可應(yīng)用于生物體系中ATP的熒光檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明提出的納米熒光傳感器可在1.0X 10_1(1?8.0X 10 -9M范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的高靈敏、高選擇性檢測(cè)。該傳感器及其檢測(cè)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力和廣闊的應(yīng)用前景，可用于ATP的特異性檢測(cè)，為癌癥等重大疾病的早期診斷及治療提供新的途徑和方法。
【附圖說明】
[0017]圖1不同ATP濃度的熒光信號(hào)強(qiáng)度。
[0018]圖2ATP濃度與熒光信號(hào)強(qiáng)度的線性關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下是本發(fā)明涉及的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0020]下面通過實(shí)施例具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限定。
[0021]實(shí)驗(yàn)儀器:磁性分離架(天津倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心);F_4600熒光分光光度計(jì)(日立，日本)JHZ-82A氣浴恒溫振蕩器(金壇市醫(yī)療器械廠)。
[0022]實(shí)驗(yàn)試劑:3-4μπι巰基修飾磁珠(天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心)；羅丹明B (阿拉丁)；三磷酸腺苷(ATP) ;ATP 適體鏈:ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT, PBS溶液為 0.0IM (pH 7.4